К вопросу о специфичности спектрофотометрического метода определения этилового алкоголя в крови и моче человеческих трупов

В ходе изучения возможности применения спектрофотометрического метода в условиях морга для количественного определения этилового алкоголя в крови и моче трупов, естественно, возник вопрос о специфичности указанной методики. В связи с этим данная методика была проверена на ряде химических соединений, способных перегоняться с водяным паром и имеющих токсикологическое значение (пиридин, аммиак, красный и белый фосфор, четыреххлористый углерод, хлороформ, нитробензол, дихлорэтан, этиленгликоль, хлоралгидрат, этиловый эфир, анилин, ментол, ацетон, ацетальдегид, фенол, метиловый спирт, пропиловый, бутиловый, амиловый спирт и их производные, формальдегид, а также политура № 13, нитролак 930, нитролак НЦ-49 и нитроокраска М-300¹.

Исследования вели спектрофотометрическим методом в модификации В.М. Колосовой². Сущность этой методики заключается в восстановлении алкоголем бихромата калия, растворенного в серной кислоте. В зависимости от количеств алкоголя раствор бихромата калия изменяет свою окраску от оранжевой до темно-синей. По градации переходных оттенков визуально или спектрофотометрически, по отношению к эталонным растворам этилового спирта и в контрольной пробе, определяют количественное содержание алкоголя в объектах.

Техника проведения анализа следующая: в стеклянный бюкс диаметром 5 см и высотой 4 см помещают белый керамический тигель емкостью не менее 2,5 мл, в который отмеривают 2 мл раствора бихромата калия в серной кислоте. На дно бюкса отмеривают 1 мл исследуемого объекта (кровь, моча); для ускорения диффузии алкоголя к объекту добавляют 1 мл 10% раствора карбоната калия. Бюкс, тщательно закрытый притертой крышкой, помещают на 30 минут в термостат при 48—50°. Вместе с исследуемыми объектами ставят эталонные пробы с водными растворами этилового спирта в концентрациях 0,4; 2; 4‰, а также контрольную пробу. В каждом случае ставится по 2 серии проб.

После извлечения бюксов из термостата проводят предварительную визуальную количественную оценку результатов анализа. Точное количественное определение этилового спирта осуществляют путем спектрофотометрирования растворов бихромата калия в объектах и в эталонных пробах по отношению к контрольной пробе. Спектрофотометрирование можно производить на любом фотометре; мы пользовались универсальным фотометром ФМ.

Описанная методика обладает достаточной точностью (±0,2‰), технической доступностью и оперативностью, причем ею можно пользоваться непосредственно у секционного стола. Для выполнения анализа требуется 1—2 мл объекта (кровь, моча). Затрата времени при визуальной количественной оценке результатов по 10—12 объектам составляет около часа; при спектрофотометрировании — 3—4 часа.

Для повышения специфичности рассматриваемой методики В.М. Колосова предложила одновременно с количественным определением этилового алкоголя по степени восстановления раствора бихромата калия проводить качественную визуальную оценку по разности окислительно-восстановительного потенциала со вторым индикатором — водным раствором перманганата калия (0,012%).

Техническое выполнение анализа остается таким же, как было указано выше, но в бюкс вместо одного помещают 2 тигля. В один из них отмеривают 2 мл раствора бихромата калия в серной кислоте, в другой— 0,5 мл водного раствора перманганата калия. По извлечении бюксов из термостата, помимо количественной оценки результатов по окраске раствора бихромата калия, проводится качественная визуальная оценка путем сравнения окраски двух указанных индикаторов. При наличии этилового алкоголя в зависимости от его концентрации раствор перманганата калия восстанавливается, изменяя свою окраску от красно-фиолетовой, через переходные оттенки, до буро-коричневой, а раствор бихромата калия — соответственно от оранжевой до темно-синей. В случае присутствия метилового алкоголя раствор перманганата калия не изменяет своей окраски в течение 3—4 часов наблюдения, а раствор бихромата калия восстанавливается значительно интенсивнее, чем при наличии этилового алкоголя — примерно в 4 раза, т. е. при концентрации метилового алкоголя 1‰ окраска раствора бихромата калия будет такой же, как при концентрации этилового алкоголя 4‰. При наличии ацетона раствор перманганата калия также не изменяет своей окраски, как и при наличии метилового алкоголя, но раствор бихромата калия реагирует значительно слабее, чем при этиловом спирте. Такой же принцип оценки применяется и к другим выявляемым химическим веществам.

При проверке специфичности спектрофотометрической методики оказалось, что пиридин, аммиак, красный и белый фосфор, четыреххлористый углерод, хлороформ, нитробензол, дихлорэтан, этиленгликоль и хлоралгидрат не влияют на результаты реакции. Метиловый спирт, этиловый эфир, анилин, ментол, ацетон, ацетальдегид, фенол, формальдегид, политура № 13, нитролак 930, нитролак НЦ-49 и нитрокраска М-300 вызывали различные изменения в окрасках растворов бихромата калия и перманганата калия, не сходные с этиловым спиртом. При этом следует отметить, что для более четкого разграничения цветовых изменений при малых дозах (ниже 0,8‰) ряда химических веществ, следует увеличить экспозицию пребывания проб в термостате до 50—60 минут при температуре 50°. Для этого используют вторую серию проб, которую ставят в термостат одновременно с первой, как было указано выше.

Однако пропиловый, бутиловый и амиловый алкоголя, а также их производные и при использовании двух индикаторов давали в одинаковых концентрациях с этиловым алкоголем сходные реакции, что не позволяло отдифференцировать их от последнего.

Для исключения влияния пропилового, бутилового, амилового ал- коголей и их производных при количественном определении этилового алкоголя спектрофотометрическим методом мы использовали реакцию с сернокислым раствором мета-нитробензальдегид а (0,2 г мета-нитробензальдегида в 10 мл концентрированной серной кислоты), предложенную Бемом и Бодендорфом (Boehm, Bodendorf) и видоизмененную Швердом и Гархамером (Schwerd, Garhammer)³.

Визуальная оценка окрасок индикаторов в присутствии ряда химических веществ

Примечание. Окраски индикаторов, указанные в таблице, соответствуют пробам, которые находились в термостате в течение 30 минут при 48°. Визуальная качественная оценка этих проб проводилась сразу по извлечении их из термостата. Если увеличить время прогревания проб в термостате, то окраски индикаторов становятся более четкими.

Техника спектрофотометрической методики при этом не изменяется, за исключением дополнительного введения в анализ третьего индикатора. В бюксы ставится не по 2, как было описано выше, а по 3 тигля, причем в третий тигель отмеривают 1 мл сернокислого раствора мета- нитробензальдегида.

Этот индикатор или бесцветен или имеет светло-розоватый цвет. Он не изменяется под воздействием метилового спирта. При концентрациях этилового спирта, имеющих судебно-медицинское значение (порядка 10%), окраска мета-нитробензальдегида также заметно не изменяется. В присутствии же пропилового, бутилового и амилового алкоголей, а также их производных, даже в минимальных концентрациях (менее 0,2‰), окраска индикатора резко изменяется, приобретая в присутствии пропанола насыщенный коричневый цвет, бутанола — коричневый, амилового, изоамилового и изобутилового алкоголя — темно-красно-коричневый цвет (вишневый), в присутствии изопропанола — темно-розовый, а при больших концентрациях — красный цвет.

Такие четкие цветовые реакции дают возможность свободно отдифференцировать указанные спирты, а также смеси их даже в самых незначительных концентрациях, от этилового алкоголя при визуальной оценке результатов спектрофотометрического анализа.

Мы провели также экспериментальные исследования с использованием пара-нитробензальдегида в качестве третьего индикатора взамен мета-нитробензальдегида. При этом были получены хорошие результаты цветных реакций с пропиловый, бутиловым, амиловым алкоголями и их производными в концентрациях менее 0,2‰, но изопропиловый спирт в концентрации ниже 1‰ давал слабо положительную реакцию. Первоначальный буровато-желтоватый цвет пара-нитробензальдегида под влиянием указанных спиртов изменялся в коричневый и черно-коричневый. Визуальная оценка окрасок индикаторов в присутствии ряда химических веществ приводится в таблице.

Из сказанного следует, что спектрофотометрическая методика с применением 3 указанных выше индикаторов дает возможность качественно констатировать присутствие этилового спирта, отличая его от ряда других веществ, которые могут содержаться в объектах судебномедицинской экспертизы, и одновременно с достаточной точностью определять его количественное содержание. Данная методика специфична только для этилового алкоголя. Во всех остальных случаях можно говорить либо о присутствии, помимо этилового спирта, каких-либо других примесей, либо только о последних. Распознавание их требует специальных судебнохимических исследований. Это относится также и к крови, находящейся в состоянии гнилостного разложения, при исследовании которой мы в ряде экспериментов устанавливали по разности окрасок индикаторов наличие наряду с этиловым алкоголем каких-то других редуцирующих веществ или обнаруживали, что в крови этиловый спирт отсутствует, но имеются какие-то редуцирующие вещества.

Выводы

1. Спектрофотометрическое количественное определение этилового алкоголя в крови и моче трупов технически несложно, оперативно и достаточно точно, оно требует небольшого количества объекта исследования (1—2 мл). Практическое использование этой методики было ограничено ее недостаточной специфичностью.
2. Применение трех индикаторов (раствор бихромата калия в серной кислоте, водный раствор перманганата калия и раствор мета-нитробензальдегида в серной кислоте) дает возможность спектрофотометрически отдифференцировать этиловый спирт от ряда веществ, способных перегоняться с водяным паром и имеющих судебномедицинское токсикологическое значение.

¹ Основной состав политур: смола № 106, циклогексаноформальдегидная смола, этилцеллюлоза, коллоксилин ПСВ (сухая), спирт в коллоксилине, трикрезилфосфат, масло касторовое, этилцеллозольв, спирт бутиловый, спирт этиловый, толуол. Нитроэмали и нитролаки представляют собой растворы нитроцеллюлозы и смол в летучих органических растворителях с добавлением пигмента и пластификаторов. Рецептура политур, нитроэмалей и нитролаков весьма обширна.

² Колосова В.М. Судебномедицинская экспертиза, 1961, № 1, стр. 7. Карандаев И.С. Сборник трудов IV Всесоюзной конференции судебных медиков. Рига, 1962, стр. 473.

³ Schwerd und Garhammer Dber den Nachweis von niederen primaren Alkoholen der aliphatischen Reihe und deren Bildung in faulenden Blut. Dtsch. Z. f. d. ges. ger. Med, 1953—,1954, S. 42, 75.