Определение алкоголя в крови ферментативным методом

В последнее время за границей широко применяют ферментативный (энзимный) способ определения этилового алкоголя в крови живых лиц и трупов, так называемый метод АДГ.

Сущность его состоит в том, что алкогольдегидрогеназа (АДГ) катализирует окисление этилового спирта в уксусный альдегид.

Акцептором водорода в данной реакции является дифосфопиридиннуклеотид (DPN), который в виде восстановленной формы адсорбирует ультрафиолетовые лучи в области 366 ммк.

С помощью стандартного раствора строят калибровочный график, а затем по измеренной на фотометре экстинкции исследуемого раствора производят расчет концентрации алкоголя.

Рис. 1. Комплект ферментов для определения
алкоголя в крови.


Рис. 2. Калибровочный график.

Мы определяли алкоголь в искусственных смесях с кровью и в экспертном материале одновременно 3 методами: высаливанием по А.И. Гринбергу, нитритным методом по Е.С. Ковалевой, энзимным методом по Bucher и Theorell с некоторыми изменениями, принятыми в Берлинском институте судебной медицины.

Применяли комплекты ферментов Blutalkohol-Test (Fermognost) производства ГДР (Дрезден), содержащие 2 флакона DPN и 1 флакон АДГ (рис. 1). Один комплект дает возможность проводить до 50 исследований. Хранят ферменты в холодильнике при температуре от 0 до 5°.

Построение калибровочной кривой и методика определения алкоголя. Для приготовления стандартного раствора с точным содержанием этилового алкоголя можно применять солянокислый гликокол-этиловый эфир (по Серенсену), который в процессе щелочного гидролиза образует этиловый алкоголь. Для этой цели также рекомендуется абсолютно свободный от воды этиловый алкоголь фирмы «Меrск-972». Мы готовили стандартный раствор на абсолютном этиловом алкоголе.

По ОД, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 и 0,6 мл точно приготовленного 1% этилового алкоголя вносили в пробирки, после чего в каждую пробирку добавляли по 1,4 мл крови, не содержащей алкоголя¹ . Содержимое пробирок доводили до 2 мл дважды дистиллированной водой и тщательно перемешивали.

В центрифужную пробирку вносили по 4 мл хлорной кислоты (2,9 мл 70% хлорной кислоты с удельным весом 1,67 помещают в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят до метки дважды дистиллированной водой) и 0,5 мл стандартного раствора этилового спирта с сывороткой или 0,5 мл исследуемой крови, тщательно перемешивали стеклянной палочкой, закрывали резиновой пробкой и центрифугировали в течение 5 мин. при 3000 об/мин. При этом выпадает осадок белков.

В градуированную пробирку пипеткой последовательно вносили 4,8 мл буферного раствора² , 0,1 мл разведенного DPN³, осторожно перемешивали содержимое вращением пробирки и постукиванием по стенкам. Затем к жидкости добавляли 0,1 мл центрифугата, полученного ранее из крови или сыворотки. В эту же пробирку вносили 0,02 мл суспензии АДГ, еще раз хорошо перемешивали, тщательно закрывали пробкой и помещали на 70 мин. в термостат или на водяную баню при 21—26а (оптимальная температура 25°), после чего измеряли экстинкцию раствора при длине волны 366 ммк.

Одновременно ставили слепой опыт с кровью или сывороткой ее, не содержащей алкоголя.

Экстинкцию измеряли на фотометре «Хавеман» в кювете с толщиной слоя 1 см.

Полученная калибровочная кривая (рис. 2) пригодна для определения содержания этилового алкоголя в крови. При определении алкоголя в сыворотке крови необходим другой график. Для концентраций спирта выше 2,5% берут двойную дозу DPN и строят специальный калибровочный график.

По такой методике определяли алкоголь в искусственных смесях с кровью. Одновременно его определяли высаливанием, по А.И. Гринбергу и нитритным методом Е.С. Ковалевой. Результаты приведены в табл. 1.

Таблица 1

Содержание алкоголя (в ‰) в искусственных смесях с кровью при различных методах определения

Полученные данные показывают, что ферментативный метод определения этилового спирта достаточно точен и не уступает нитритному методу и высаливанию, а в ряде случаев дает лучшие результаты.

Всего мы провели 76 определений спирта ферментативным методом, в том числе и в экспертном материале. При исследовании экспертного материала методами высаливания, нитритным и ферментативным для исследования брали кровь.

Результат определения этилового алкоголя в экспертном материале приведен в табл. 2, из которой видно, что расхождения при применении указанных методов не превышают 0,3°/оо. При этом ферментативный метод имеет ряд существенных преимуществ. Он является микрометодом и требует в 400—600 раз меньше материала, чем высаливание. Его можно применить для определения этилового алкоголя в крови живых лиц и трупов. Он

Таблица 2

Результат определения этилового алкоголя в крови

Метод определения достаточно прост и особенно удобен для серийных определений. При этом 0, 5 мл крови после осаждения белков дают возможность провести ряд повторных определений.

Выводы

1. Построен калибровочный график и определено содержание этилового алкоголя в одной и той же крови одновременно энзимным, нитритным методами и высаливанием.
2. На экспертном материале показано, что расхождение в результатах, полученных при определении указанными 3 методами, не превышает 0,3%о. Ферментативный метод имеет ряд преимуществ: является микрометодом, может быть применен для определения этилового алкоголя в крови живых лиц и трупов, его можно применять при серийных определениях.

¹ Если для приготовления стандартных растворов используют сыворотку (1,4 мл), то для определения алкоголя необходима также сыворотка крови.

² 8,34 г пирофосфата натрия, 2,08 г солянокислого семикарбазида и 0,416 г гликокола растворяют в 200 мл дважды дистиллированной воды, добавляют 8,34 мл 2 н. раствора едкого натра и доводят дважды дистиллированной водой до 250 мл. Полученный буферный раствор имеет pH около 8,7.

³ К содержимому склянки с DPN добавляют 2,85 мл дважды дистиллированной воды, закрывают пробкой и осторожно встряхивают в течение 5 мин. Разведенный DPN можно хранить в холодильнике при температуре от 0 до +5° в течение 2 недель.