Одномоментное обнаружение кислой фосфатазы, холина, спермина и аминокислот спермы в пятне хроматографией на бумаге

За последнее время появились методы, позволяющие выявлять в исследуемых объектах специфические для спермы вещества. Keve (1949), Tesaf (1953), В.И. Чарный (1965) и др. придают важное значение кислой фосфатазе, считая, что в сперме содержание ее значительно больше, чем в других выделениях организма. Fiori (1957) считает доказательным для спермы обнаружение спермина. Levonen (1960), Буреш (1968), Д.Д. Джалалов (1969), Yano (1970) полагают, что наиболее специфично обнаружение свободного холина и спермина. Кроме того, семенная жидкость в отличие от других выделений характеризуется содержанием большого количества свободных аминокислот (Fiori, 1957; Д.Д. Джалалов, 1963, 1964).

Каждая из этих методик, взятая по-отдельности, на наш взгляд, не достоверна, однако в совокупности при соответствующих обстоятельствах все они могут подтвердить семенное происхождение пятна, даже тогда, когда обнаружить сперматозоиды не удается.

Существующие способы определения спермина, холина, кислой фосфатазы и аминокислот в пятнах спермы длительны и требуют много исследуемого материала. Поэтому, если имеются пятна очень малого размера, определение каждого из указанных веществ отдельным методом практически невозможно.

Отсюда понятно, насколько важно разработать метод, позволяющий определить одновременно холин, спермин, кислую фосфатазу и свободные аминокислоты в минимальном количестве материала. Для этого мы применили хроматографию на бумаге.

Использовали восходящую хроматографию в нашей модификации Камерой для растворения пятен и проявления хроматограмм служил аквариум 20×30×40 см. Внутри в верхней части к противоположным стенкам прикрепляли 2 одинаковые стеклянные трубки в виде мостика. Затем изготовляли бумагодержатели. Для этого две такие же трубочки на 0,5 см короче длины камеры скрепляли у концов кольцами, отрезанными от резиновой трубки. Между трубками зажимали концы полосок или лист хроматографической бумаги 25X39 см в соответствии с размерами камеры. По длине его прочерчивали простым карандашом 10 полосок (можно меньше, соответственно количеству объектов) шириной по 25 мм. На расстоянии 25 мм от одного конца листа обозначали линию старта, затем в каждой полоске делали разрезы для закрепления в них объектов исследования.

Вырезки диаметром 0,6 см (можно делать ножницами или дыроколом) из каждого пятна увлажняли 1% раствором фосфатфенолфталеиннатра в ацетатном буфере (рН 5,3), прогревали 1 ч при температуре 37°, затем вставляли в надрезы у стартовой линии. Хроматографировали с растворителем: бутанол, уксусная кислота и вода в соотношении 4:1:5. Для лучшего разделения целесообразно хроматографировать 48 ч.

Хроматограмма пятен спермы 8 мужчин.
А — обнаружение холина и спермина; Б — обнаружение свободных аминокислот; В — обнаружение кислой фосфатазы.

Поэтому хроматограмму после первого раза (24 ч) вынимали, высушивали и пропускали через эту же камеру второй раз.

Хроматограммы высушивали при комнатной температуре и обрабатывали тремя разными проявителями в следующей последовательности. Вначале проявляли холин и •спермин. Для этого высушенную хроматограмму помещали в герметическую камеру, насыщенную парами проявителя. Проявитель готовили следующим образом: 1) 30 г йодистого калия растворяли в 70 мл воды и добавляли 3 г йода; 2) 10 г основного азотнокислого висмута растворяли в 30 мл концентрированной азотной кислоты. Оба раствора смешивали и оставляли до полного выпадения осадка. Осадок помещали на дно камеры для проявления хроматограмм. При этом на каждой полоске проявлялись две зоны. Одна — у стартовой линии, желтовато-бypая (спермин), другая — (несколько выше первой, коричневато-красная (холин). Величина и интенсивность окраски зон зависит от количества искомых веществ (см. рисунок).

Зоны, проявившиеся на хроматограммах, через некоторое время исчезали, после чего хроматограмму опрыскивали 0,1 % раствором нингидрина в хлороформе для проявления свободных аминокислот. При этом обнаруживали от 6 до 11 аминокислот в виде цепочки. Расположение их следующее: цистин, аминоуксусная кислота, серин, аланин, тирозин, метионин, лейцин, аргинин, аспарагиновая кислота, глицин, валин (см. рисунок, Б).

После этого ту же хроматограмму обрабатывали третьим проявителем, чтобы установить кислую фосфатазу.

Для этого верхнюю часть хроматограммы опрыскивали 0,1 н. раствором едкого натра. При этом вблизи линии растворителя проявлялся в виде розово-красной зоны фенолфталеин, отщепленный от фосфатфенолфталеиннатра действием кислой фосфатазы спермы. Величина и интенсивность зоны зависела от активности фермента в объекте (см. рисунок В).

Таким образом, путем обработки хроматограммы одной вырезки пятка тремя проявителями выявляли кислую фосфатазу, спермин, холин и свободные аминокислоты.

Материал и результаты исследования

Исследовали сперму с различными морфологическими признаками (азооспермия, олигозооспермия, нормоспермия) давностью от 2 нед до 6 лет. Пятна спермы располагались как на индифферентных предметах-носителях (фильтровальная и хроматографическая бумага), так и на текстильных тканях разных видов, сортов, цветов и оттенков. Всего исследовали 168 пятен. Во всех случаях на хроматограммах выявлялись четко выраженные зоны отщепленного действием кислой фосфатазы фенолфталеина, а также холина, спермина и свободных аминокислот.

Мы проверили чувствительность метода, т. е. определили наименьшую величину пятна спермы, содержащего минимальное количество указанных выше веществ. Оказалось, что пятно, образованное 0,0025 мл семени независимо от давности и морфологической особенности содержит те минимальные количества фосфатазы, холина, спермина, свободных аминокислот, которые дают четкие хроматограммы.

Проверяли и специфичность метода. Для этого исследовали по 4 образца пятен секрета влагалища, пота, крови, гноя, женского молока, мокроты, слезной жидкости, мочи, выделений из носа и по 2 образца пятен соков ягод, фруктов, овощей и зеленых листьев растений, нанесенных на индифферентные предметы-носители — фильтровальную или хроматографическую бумагу. Ни в одном случае не получили характерной для пятна спермы хроматограммы — полоски с объектами обычно оставались чистыми, неизмененными, лишь с некоторыми образцами секрета влагалища, гноя, мокроты выявляли незначительной величины и интенсивности пятна аминокислот и кислой фосфатазы. Зон холина и спермина не выявляли ни разу. На полосках с соком зеленых растений иногда проявлялась едва заметная зона кислой фосфатазы или 2—3 свободные аминокислоты, спермин и холин не выявлялись. Помимо этого, на хроматограммах зеленых листьев растений проявлялись бледно-зеленые или зеленовато-желтые потеки растворенного хлорофилла, которых никогда не было на полосках с пятнами спермы (такие же потеки наблюдали на хроматограммах пятен крови).

Вырезки из объектов, вставленные в надрезы хроматографической бумаги, после пропускания через них растворителя надо снимать до появления хроматограмм, так как эти вырезки подвергают дальнейшему исследованию для обнаружения сперматозоидов, которые в них легко выявляются.

Выводы

1. Одномоментное определение кислой фосфатазы, холина, спермина и аминокислот спермы в пятне методом хроматографии на бумаге возможно вне зависимости от морфологических особенностей спермы.
2. Минимальное количество спермы, достаточное для получения хроматограммы холина, спермина, кислой фосфатазы и свободных аминокислот, 0,0025 мл.
3. Хроматограмма пятна спермы резко отличается от хроматограмм пятен соков растений, женского молока, слюны, пота, выделений из носа, секрета влагалища, слезной жидкости, мочи, мокроты, крови и гноя.
4. Одномоментное определение кислой фосфатазы, холина, спермина и аминокислот в пятне более достоверно, чем обнаружение этих веществ в отдельности для определения семенного характера следов. В вырезках, использованных для хроматографирования, сперматозоиды сохраняются и могут быть обнаружены.

¹ Д.Д. Джалалов. Материалы 5-й Всесоюзной конференции судебных медиков, 1969, 2, с. 257—259.