Использование особенностей спектра изоферментов лактатдегидрогеназы спермы человека для установления ее наличия в смешанных пятнах

В задачу исследования входило изучение особенностей спектра изоферментов лактатдегидрогеназы (ЛДТ; ФК 1. 1.1.27) некоторых выделений человека, (сперма, слюна, влагалищные выделения, молоко, молозиво), вытяжек из экспериментальных пятен спермы и смешанных пятен с целью судебно-медицинской диагностики и дифференциации указанных выделений и крови в смешанных пятнах.

Метод исследования. В последнее время широкое распространение в нашей стране получил метод электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Он использовался судебными медиками для различных целей: изучения белкового состава спермы и биологических смесей (В.В. Зайцев, Б.П. Мищенко, 1972, 1973; М.Я. Зингерман, 1973), исследования групп гаптоглобина и Gc (Н.Н. Старостин, 1974, 1975), дифференциации прижизненных и посмертных повреждений (А.С. Гладких, 1975), для посмертной диагностики острой ишемической болезни сердца (Т.М. Уткина, А.Ф. Кин-ле, 1975), определения давности наступления смерти (Б.М. Лисянский, 1975) и др. В экспертизе вещественных доказательств также наметились определенные перспективы, связанные с изучением ЛДГ: особенности распределения изоферментов ЛДГ-4 и ЛДГ-5 в менструальной и периферической крови можно использовать для решения вопроса о региональном происхождении крови (Asano и соавт., 1971), активность указанного фермента сохраняется в пятне до 10 мес, что может служить одним из критериев обнаружения крови в пятнах (de Ferrari и соавт., 1972).

Мы использовали метод диск-электрофореза в ПААГ на приборе оригинальной конструкции (с особенностями устройства как самого прибора, так и используемых для геля — носителя трубок), позволяющем получить четкое фракционирование изоферментов с минимальным снижением ферментативной активности за счет электрофореза и полностью исключить артефакты типа сферической аберрации при последующей денситометрии образцов.

Рис. 1. Прибор для электрофореза в полиакриламидном геле. А — верхняя электродная камера; Б — нижняя электродная камера.

Это достигали тем, что через нижнюю полость верхней камеры (рис. 1) пропускали воду (предварительно проходившую через сосуд со льдом), которая непосредственно соприкасалась с трубками из кварцевого стекла, имеющими плоскопараллельный профиль сечения. Конструктивно наш прибор напоминает известный прибор для вертикального электрофореза с промежуточными трубками (Neren, 1966, патент № 3290240 по классу США 203—199). Однако он более портативный, позволяет одновременно исследовать большее количество образцов и не требует значительного количества реактивов.

Разделение производили в 5% ПААГ с непрерывной буферной системой (трис-ЭДТА-боратный электродный буферный раствор с pH 8,3) при напряжении 8 В, на трубку в течение 50 мин. Зоны изоферментов ЛДГ обнаруживали методом Markert и соавт. (1959): образцы инкубировали в предложенной ими смеси в течение 1 ч при температуре 37°, затем полоски геля промывали водой и заливали 7% раствором уксусной кислоты для прекращения ферментативной реакции. Относительное количественное содержание изоферментов ЛДГ определяли прямым денситометрированием полосок геля на интегрирующем денситометре «Хромоскан» (Джойс и Лейбл, Англия) при 520 нм. Содержание изоферментов рассчитывали в процентах.

Материал исследования. Материалом для исследования служили семенная жидость 89 мужчин, кровь, слюна и влагалищные выделения — по 15 образцов, молозиво и молоко—40 образцов, вытяжки из различной давности экспериментальных пятен спермы — 60, смешанные пятна (состоящих из спермы, крови и других перечисленных выделений в различных комбинациях) — 120. При предварительном морфологическом исследовании эякулятов их удалось разделить на несколько групп: нормозооспермия (33), олигозооспермия различной тяжести (48), азооспермия (5). Изученные образцы молозива и молока относились к различным срокам лактационного периода.

Результаты исследования. Молозиво и молоко. Исследовано 40 образцов молозива и молока женщин, находившихся в родильном доме по поводу предстоящих родов или в послеродовом периоде. Секрет получали при сроке беременности 36—44 нед и через 1, 2, 3, 5, 6, 10 сут после родов при нормагалактии.     Установлена четкая динамика снижения общей активности ЛДГ (от 1730±430 ед. при беременности до 200±33,2 ед на 5-й день после родов), которая сохраняется до 10-го дня после родов. Во всех образцах обнаружено 5 изоферментов ЛДГ ( рис. 2, А, на вклейке).

Анализ результатов показывает, что по процентному содержанию изоферментов ЛДГ можно дифференцировать молозиво и молоко, причем при исследовании молока в первые 10 дней можно решить вопрос о сроке, прошедшем после родов. Решающее значение при этом приобретают изоферменты ЛДГ-1 и ЛДГ-5. Наши исследования подтвердили выводы Kjellberg и соавт. (1966, 1967) о различиях в изоферментном составе женского молока в зависимости от лактационного периода.

Семенная жидкость. При исследовании плазмы семенной жидкости 89 мужчин в случаях присутствия в эякуляте сперматозоидов нам удалось обнаружить 6-й изофермент— ЛДГх, открытый впервые в ткани яичника в 1963 г. Blanco, Zinkham (рис. 2, Д). Нам не удалось установить закономерного изменения общей активности ЛДГ в зависимости от числа сперматозоидов в эякуляте.

Слюна и влагалищные выделения. Как показал анализ жидких образцов слюны и влагалищных выделений, активность ЛДГ представлена в них в основном за счет изофермента ЛДГ-5 (до 55—60%) Во всех случаях удалось обнаружить пять основных изоферментов ЛДГ (рис. 2, В).

Жидкая кровь. При исследовании образцов жидкой крови мы получили результаты, мало отличающиеся от известных в литературе. За счет присутствия в образцах форменных элементов —- эритроцитов наиболее активно были выражены изоферменты ЛДГ-1 и ЛДГ-2. Во всех образцах удалось обнаружить пять основных изоферментов.

Пятна спермы. Исследовали вытяжки из экспериментальных пятен спермы давностью 1, 7, 17, 30 сут (всего 60 вытяжек). Для изготовления указанных пятен на хлопчатобумажную ткань белого цвета помещали по 1 мл семенной жидкости 15 мужчин, пятна хранили в чашках Петри на свету, при температуре 20—22°С и относительной влажности воздуха 60—80%. Вытяжки готовили, вымачивая участок пятна (размером 1X1 см) буферным электродным раствором (0,5 мл) в течение 1 сут при температуре 4°С. В процессе исследования установили, что в вытяжке из пятен спермы давностью 1 сут увеличивается (31,2±3,8) относительное количество ЛДГ_Х. Это следует объяснить выходом изофермента за пределы клеток (сперматозоидов). Изофермент ЛДГ-5 к указанному сроку не успевает значительно разрушиться (6,7±1,1) Через 7 сут картина изменяется: несколько уменьшается относительное содержание ЛДГ_Х (26,7±2,4) и резко падает количество ЛДГ-5 (1,1±0,3) Через 17 сут ЛДГ-5 определить не удалось, а ЛДГ_Х обнаружили только в половине случаев. По всей видимости, в пятнах, имеющих давность свыше 2 нед, начинает разрушаться и такой стойкий компонент, как ЛДГ_Х. Полученные нами данные в значительной степени совпадают с результатами работы Farriaux и соавт. (1967). При исследовании пятен, изготовленных из спермы лиц, страдающих азооспермией, определить компонент ЛДГ_Х как в пятнах, так и в указанных эякулятах не удалось (рис. 2, Г, 3, Б, на вклейке). По-видимому, следует считать преждевременным, нуждающимся в проверке вывод А.С. Гладких и соавт. (1974) о локализации ЛДГ_Х в семенной плазме, а не в сперматозоидах, а следовательно, и об установлении присутствия спермы в пятнах в случаях азооспермии.

Смешанные пятна. Учитывая потребности практической судебномедицинской экспертизы, мы экспериментально изготовили и исследовали по 15 смешанных пятен, состоящих из спермы и крови, спермы и влагалищных выделений, спермы и молока, спермы и слюны, спермы и всех вышеуказанных выделений. Смешанные пятна готовили так же, как и пятна спермы, при этом брали по 0,5 мл каждого выделения. Всего исследовали изоферментный состав ЛДГ вытяжек из 75 пятен. Поскольку нас интересовала лишь принципиальная возможность выявления примеси спермы в смешанных пятнах, вытяжки были изготовлены из пятен давностью 24 ч. Во всех случаях удалось обнаружить специфический спермальный компонент ЛДГ_Х. Помимо этого, можно было судить о наличии в пятне не только спермы, но и других выделений. Так, например, в смешанных пятнах, состоящих из спермы и влагалищной слизи, изофермент ЛДГ-5 имел относительное содержание в 2¹/₂ раза больше, чем в пятнах «чистой» спермы и других смешанных пятнах. Изофермент ЛДГ-1 был, наоборот, более интенсивно выражен в смешанных пятнах, чем в пятнах «чистой» спермы (см. таблицу).

Относительное содержание (в %) ряда изоферментов, ЛДГ в вытяжках из пятен спермы и смешанных пятен (M±m)

Примечание. В скобках указаны коэффициенты достоверности по сравнению с соответствующими показателями пятна спермы давностью 1 сут.

Выводы

Проведенное исследование показало возможность установления присутствия спермы в пятнах давностью до 3 нед и в смешанных пятнах (состоящих из спермы и других выделений и крови человека) давностью до 2 нед. Это достигается биохимическим определением в вытяжках из указанных пятен специфического только для семенной жидкости, содержащей сперматозоиды, компонента — изофермента лактатдегидрогеназы — ЛДГх- По особенностям спектра изоферментов ЛДГ молока, влагалищных выделений, слюны, выявленных нами, в ряде случаев можно сделать вывод о присутствии в пятнах указанных выделений.

Рис. 2. Образцы изоферментов лактатдегидрогеназы некоторых выделений человека. А — молозиво; Б — влагалищные выделения; В — слюна; Г — семенная жидкость (азооспермия); Д — семенная жидкость (нормозооспермия). В молозиве, влагалищном выделении и слюне ЛДГ-1 составляла менее 1% общего количества ЛДГ, поэтому на рис. она не видна.

Рис. 3. Образцы изоферментов лактатдегидрогеназы спермы человека. А — нормозооспермия; Б — азооспермия. Цифры обозначают изоферменты ЛДГ (стрелкой обозначен изофермент ЛДГ_Х, знаком + — место старта образцов).