Об ориентирующем значении количественной реакции на кислую фосфатазу при установлении наличия спермы в пятнах

Трудность микроскопического исследования пятен спермы с целью обнаружения в них сперматозоидов, а также возможность отсутствия сперматозоидов в сперме (азооспермия) заставляют судебно-медицинских экспертов не прекращать усилий по разработке новых методик, доказывающих наличие спермы в пятнах.

В последние годы внимание многих исследователей привлек метод определения кислой фосфатазы. Фосфатазами называют ферменты, раз слагающие органические фосфорные эфиры с отделением неорганических фосфатов. Одни ферменты этой группы имеют оптимум действия при pH 9, 2—9, 6 (щелочная фосфатаза), другие — при pH 3,4—6, 2 (кислая фосфатаза).

Кислая фосфатаза в организме вырабатывается в основном предстательной железой и содержится в эякуляте в очень больших количествах, значительно превышающих содержание ее в других секретах и жидкостях человеческого организма.

Для определения фосфатазы разработаны качественные и количественные методики. Последние позволяют определять не только наличие, но и активность фосфатазы в исследуемой жидкости.

Исследуемую жидкость прибавляют к субстрату для фосфатазы— какому-либо органическому соединению фосфора (глицерофосфату, фенилфосфату). Через некоторое время устанавливают, какое количество этого соединения подверглось расщеплению. Это определяют по количеству либо образовавшегося неорганического фосфата (методика Боданского), либо органического соединения, в состав которого фосфор уже не входит (например, методика Кинга—Армстронга).

Активность фосфатазы выражают в условных единицах. За единицу Боданского (БЕ) принимают такое количество фосфатазы в 100 мл жидкости, которое отщепляет 1 мг неорганического фосфата, за единицу Кинга—Армстронга (КАЕ) — активность фосфатазы в 100 мл жидкости, которая освобождает 1 мг фенола из фенилфосфата; 1 БЕ=2 КАЕ.

Мы определяли кислую фосфатазу по Боданскому. В настоящее время эту методику начинают применять при клинических лабораторных исследованиях (С.Д. Балаховский и И.С. Балаховский; Тодоров). Исследуемую жидкость инкубируют с раствором (3-глицерофосфата натрия в мединаловом буфере (pH 5, 0) при 37° и через час определяют количество неорганического фосфата, отщепившегося в результате деятельности фермента. Чем больше активность фосфатазы, тем больше образуется неорганического фосфата. Последний определяют после прибавления молибденового реактива и эйконогена. Пропорционально количеству неорганического фосфата образуется молибденовая синь, которую колориметрируют на ФЭК-М при красном светофильтре против воды.

Параллельно проводят контрольный опыт, который показывает содержание в исследуемой жидкости и реактивах неорганического фосфата вне зависимости от действия фермента. Количество фосфора в основном и контрольном опытах определяют по кривой, составленной на рабочем стандартном растворе фосфора.

Проведенные нами исследования семенных пятен показали, что для получения правильного результата большое значение имеет способ извлечения фосфатазы из пятна и степень разведения исследуемой вытяжки.

Рекомендуемый некоторыми авторами способ получения вытяжки из влажной фильтровальной бумаги, прижатой к пятну, пришлось отвергнуть как не обеспечивающий полного перехода фосфатазы в исследуемую вытяжку. Наиболее полное извлечение удавалось осуществлять по несколько видоизмененному способу Тесаржа. Вырезку из пятна (1 см²) разрезали на несколько частей, заливали небольшим количеством физиологического раствора и оставляли до следующего утра в холодильнике. Затем пятно промывали 3—4 раза небольшими порциями дистиллированной воды при перемешивании стеклянной палочкой. Общий объем вытяжки доводили до 20 мл и центрифугировали или фильтровали. Из осадка готовили мазки, которые фиксировали и окрашивали эритрозином. При помощи микроскопии пытались обнаружить сперматозоиды. По 1 мл фильтрата вводили в основной и контрольный опыт.

Степень разведения вытяжки имеет большое значение. Если фосфатазы слишком много, то гидролиз глицерофосфата протекает хуже, получаются заниженные показатели активности фермента. С другой стороны, при очень больших разведениях могут быть пропущены пятна со слабой активностью фосфатазы.

Опытным путем установили, что для пятен размером 1 см² оптимальным является разведение 1: 20—1: 40. Выгоднее брать не 1 см² пятна, а 0, 25—0, 5 см². В этом случае объем вытяжки доводят до 10—15 мл. При желании можно исследовать и меньшие пятна. Мы получали хорошие результаты с пятнами на текстильных тканях весом i—2 мг, площадью 4—6 мм². Естественно, что объем вытяжки при этом соответственно уменьшали.

Таким образом, реакция на кислую фосфатазу достаточно чувствительна и позволяет исследовать небольшие пятна.

Для судебномедицинского использования данной реакции очень важен вопрос о ее специфичности для пятен спермы. Выше указано, что содержание фосфатазы, по данным многих исследований, в других выделениях и жидкостях человеческого организма весьма невелико. Так, в крови она содержится в пределах 1 БЕ (Тодоров).

Мы провели несколько серий опытов по определению содержания кислой фосфатазы в слюне, моче и крови. Оно не превышало 1 БЕ, а в свежих пятнах -— не более 1—2 БЕ на 1 см² пятна.

Perez de Petinto и Martinez не нашли в выделениях человека, напитках и пище более 5 КАЕ кислой фосфатазы. Boucherle с соавторами не нашли более 5 КАЕ кислой фосфатазы в фекалиях, моче, слюне, вагинальном секрете, крови, желудочном соке, слизи из носа, чае, кофе, молоке, желтке яйца, пиве и т. д., в то время как в сперме, по их данным, ее содержится от 200 до 2000 КАЕ. Авторы сообщают о 9 случаях определения кислой фосфатазы с одновременным микроскопическим исследованием для выяснения происхождения пятен на одежде. В 4 случаях в пятнах обнаружены сперматозоиды и кислая фосфатаза (от 50 до 180 КАЕ), в 1 — около 100 КАЕ кислой фосфатазы, сперматозоиды не были найдены (однако следствие установило, что половой акт здесь имел место), в 1—55 КАЕ кислой фосфатазы, сперматозоиды также не обнаружены; в 3 случаях результаты микроскопического и биохимического исследований были отрицательными. Авторы считают, что положительным можно считать результат с показателем не ниже 20 КАЕ на 1 см² пятна. Leinthof и Kuzias (1957), Hauk и Leithof (1959) значительно поколебали уверенность в специфичности реакции на кислую фосфатазу. Они установили, что в довольно больших количествах она содержится в соках некоторых растений. Наши исследования подтвердили наличие кислой фосфатазы в клевере и бархатце.

Тем не менее обстоятельства дела часто позволяют исключать возможность нахождения растительных ферментов на одежде. Кроме того, общий фон загрязнения одежды растительными ферментами можно установить контрольными исследованиями предмета — носителя пятна. Далее в сомнительных, а вернее, во всех положительных случаях при помощи реакции преципитации необходимо установить видовое происхождение белковых веществ в пятне. И, наконец, пятна от соков растений не дают флюоресценции. Tesar, применяя более 10 лет реакцию на кислую фосфатазу, ни разу не наблюдал ее неспецифический положительный результат. Однако возможность попадания растительных ферментов на объект экспертизы все же следует иметь в виду.

С целью изучения возможности практического применения реакции на кислую фосфатазу при судебно-медицинском исследовании вещественных доказательств мы исследовали 80 пятен в 6 судебномедицинских экспертизах. Наряду с определением кислой фосфатазы проводили микроскопическое исследование на сперматозоиды.

В первом случае исследовали подозрительные на сперму пятна на одежде потерпевшей и белье обвиняемых. Все пятна давали бледно-голубую флюоресценцию. В 7 пятнах из 13 на одежде потерпевшей найдено от 85 до 450 БЕ кислой фосфатазы (в пересчете на 1 см² пятна).

В 4 пятнах из 7 на одежде обвиняемых установили соответственно 17, 80, 194, 1625 БЕ фосфатазы. Первое из этих пятен представляло собой очень поверхностную помарку, тогда как последнее было весьма интенсивным и давало очень мутную вытяжку. Во всех пятнах, в которых была обнаружена кислая фосфатаза, найдены сперматозоиды.

Во втором случае исследовали 11 вырезок из пятен на одежде потерпевшей. В 4 пятнах обнаружены кислая фосфатаза (15, 40, 95, 470 БЕ) и сперматозоиды.

В третьем случае (изнасилование с дефлорацией) исследовали пятна крови на белье потерпевшей и простыне с места происшествия.

В 6 пятнах из 16 обнаружили от 10 до 53 БЕ кислой фосфатазы и сперматозоиды (в некоторых пятнах — только головки). В одном участке пятна крови обнаружили 2, 4 БЕ кислой фосфатазы, сперматозоиды не были найдены. Сравнительно небольшое содержание кислой фосфатазы в этом случае объясняется тем, что сперма была смешана с кровью и, следовательно, разведена последней.

В четвертом случае исследовали пятна, подозрительные на сперму, на нижнем белье обвиняемых в изнасиловании. В 6 вырезках из 13 обнаружили кислую фосфатазу (от 62 до 1193 БЕ) и сперматозоиды.

В пятом случае исследовали 6 пятен на нижнем белье потерпевшей. В 3 пятнах найдена кислая фосфатаза (228, 456, 576 БЕ) и сперматозоиды.

В шестом случае (половой акт с несовершеннолетней) на простыне, изъятой с места происшествия, обнаружили многочисленные пятна, дающие при облучении ультрафиолетовыми лучами яркую голубую (почти белую) флюоресценцию, однако сперматозоиды при микроскопическом исследовании не были найдены. Затем 12 вырезок исследовали на кислую фосфатазу. В 4 пятнах получили положительный результат (21, 44, 113 и 142 БЕ). В дальнейшем в пятнах, в которых была установлена кислая фосфатаза, в мазках из осадка на фильтре обнаружили сперматозоиды. В пятнах, где фосфатаза не была найдена, при тщательном микроскопическом исследовании сперматозоиды также не выявлены.

В процессе освоения, экспериментального изучения и практическое го использования количественной реакции на кислую фосфатазу мы провели более 200 исследований, что позволяет сделать некоторые выводы.

1. Применение количественной реакции на кислую фосфатазу не должно вызывать отказ от микроскопического исследования пятен спермы. Эта реакция может явиться дополнительным методом экспертизы, особенно в случаях, когда микроскопическое исследование дает отрицательные результаты.
2. Необнаружение кислой фосфатазы в пятне при отрицательном результате микроскопического исследования позволяет более уверенно говорить о ненахождении пятен спермы на вещественных доказательствах.
3. Обнаружение больших количеств кислой фосфатазы, видимо, позволяет заключать о семенном происхождении пятен, даже при ненахождении сперматозоидов, хотя последние случаи на практике встречаются редко (азооспермия). Следует также уточнить, какие именно количества кислой фосфатазы нужно считать доказательными для пятен спермы.
4. Обнаружение кислой фосфатазы в небольших количествах позволяет заподозрить семенное происхождение пятна и облегчает выбор участка для микроскопического исследования.

ОТ РЕДАКЦИИ

Настоящая статья печатается в качестве предварительного сообщения.

Основное значение работы В.И. Чарного редакция видит в том, что автор сделал обзор современного состояния вопроса. В иностранной литературе широко освещена реакция на кислую фосфатазу и возможности ее применения в судебно-медицинской практике. В отечественной печати этот вопрос не получил достаточного отражения. На большом материале автор апробировал методику определения кислой фосфатазы в семенных пятнах.

Однако от практического применения реакции на кислую фосфатазу как прямого доказательства наличия или отсутствия спермы в пятне пока следует воздержаться, поскольку нет критериев оценки реакции количественного определения кислой фосфатазы (об этом пишет и сам автор в 3-м выводе статьи). Предлагаемая реакция в настоящее время может иметь лишь ориентирующее значение. Достоверным доказательством семенного происхождения пятна по-прежнему остаются результаты морфологического исследования — обнаружение целых сперматозоидов или их головок.