Определение и экспертное значение изоферментов лактатдегидрогеназы в пятнах спермы

Содержание изоферментов лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в отдельных органах различно, однако они не являются органоспецифическими. В частности, в сперме имеется изофермент ЛДГ-« Х» (Blanco и соавт., 1963; Goldberg, 1964; Zinkham, 1968, 1972, и др.). ЛДГ-«Х» имеет половую и возрастную специфичность, она обнаруживается в яичках только после полового созревания. В дифференцирующихся гаметах этот фермент появляется непосредственно перед первым мей- озным делением (Goldberg, 1974) в стадии первичных сперматоцитов (Evrev и соавт., 1970, и др.). До полового созревания и при азооспермии ЛДГ-« Х» не обнаруживается ( Clausen и соавт., 1965; Evrev, 1971, и др.). Clausen (1969) обнаруживал ЛДГ-« Х», как правило, лишь в средних частях сперматозоидов. Domenech и соавт. (1970, 1972) полагают, что фермент связан с находящимися там тяжелыми митохондриями. В семенную плазму ЛДГ-« Х» поступает или путем диффузии из сперматозоидов, или вследствие их деструкции (Clausen и соавт., 1965, и др.).

ЛДГ-«Х» является биологическим признаком сперматозоидов (Вылчанов и соавт., 1972). Поэтому мы решили изучить возможность использования этого фермента для обнаружения спермы в пятнах.

Материал и метод

Посредством электрофореза на ацетилцеллюлозных пленках исследовали семенную плазму 12 мужчин с нормоспермией и у 15 мужчин исследовали сперму электрофорезом в полиакриламидном геле. Кроме того, определяли распределение ферментов в надосадочном слое после повторного отмывания сперматозоидов раствором Кребса— Рингера. После последнего отмывания остаток гомогенизировали ультразвуком и исследовали (табл. 1).

Таблица 1

Процентное отношение изоферментов в надосадочной жидкости спермы (средние данные)

Из 32 проб спермы готовили пятна на текстильных тканях. На участок площадью 1 с.м2 наносили 75 мкл спермы. Исследовали через различные промежутки времени электрофорезом на ацетилцеллюлозных пленках, используя трис-HCl-барбитуратный буфер (pH 8,3) при 100 В в течение 23 мин. Д ля выявления изоферментов применяли инкубационную смесь: НСГ 21 мг, ФМС 2,1 мг, НАД 100 мг, 50% раствор лактата натрия 0,84 мл, воды 9,7 мл. Пленку с фореграммой фиксировали, просветляли, результаты оценивали денситометрнчески. Электрофорез в полиакриламидном геле провели по методу Maurer (1968): собирательный гель pH 6,7, разделительный гель pH 8,9, трис-глицин- электродный буфер pH 8,3, длительность 120— 150 мин, сила тока в начале 2 мА, потом 5 мА. Изоферменты выявляли реакцией с формазаном по van der Helm (1961).

Результаты

На электрофореграмме ЛДГ-«Х» выявляется между ЛДГ-3 и ЛДГ-4 (см. табл. 1). Относительное содержание ее повышается с каждым отмыванием и после третьего отмывания жидкость практи чески содержит лишь ЛДГ-«Х».

Сохраняемость изоферментов Л Д Г показана в табл. 2. Из 85 пятен давностью от 2 до 36 дней в 77 (90,5%) удалось денситометрически определить Л Д Г (рис. 1, 2, см. вклейку), а в 4 случаях ЛДГ-«Х» выявили даж е через 60 дней.

За время хранения процентное соотношение изоферментов изменялось незначительно — уменьшалось содержание катодных изоферментов относительно анодных (см. табл. 2).

Таблица 2

Процентное отношение изоферментов в пятнах спермы различной давности

В 15 пробах семенной плазмы через 2 ч после эякуляции средняя активность ЛДГ-« Х» составила 14,5 отн.%. При электрофорезе в ацетилцеллюлозе в пятнах давностью 24 ч определяли среднюю активность ЛДГ-« Х» — 28,8 отн.%.

По Clausen и Ovlisen (1965), в свежей сперме-средняя активность ЛДГ-« Х» составила 34%, по Eliasson и соавт. (1967) — 33,8 ± 12,5%. Они установили корреляцию между числом сперматозоидов и актив ностью ЛДГ-«Х». Evrev (1971) при электрофорезе в полиакриламидном геле обнаруживал ЛДГ-« Х» в пятнах давностью до 10 дней. F arriaux и соавт. (1967) нашли ее в пятнах давностью до 35 дней. Эти авторы не проводили денситометрических измерений. Наши исследования подтвердили длительную сохраняемость активности изофермен тов Л Д Г в высушенных пятнах спермы.

А.С. Гладких и Д.Г. Гадакчян (1974) указывали, что ЛДГ-« Х» содержится в семенной плазме, но не в сперматозоидах. Это утверждение неправильно: ЛДГ-«Х» является специфическим внутриклеточным изоферментом Л Д Г в сперме. Отсутствие ее в спермолизатах, которые исследовали Гладких и Гадакчян, по-видимому, объясняется погрешностями при подготовке материала.

ЛДГ-«Х» содержится также в сперме млекопитающих и некоторых птиц (Zinkham, 1972). Поэтому определению ЛДГ-« Х» всегда должно сопутствовать доказательство человеческого белка.

Многие антигены спермы свойственны только семенной плазме. Сюда относятся, например, кислая простатическая фосфатаза ( Д ж а- лалов, 1974; Höhn; Walther и Leithoff, 1971), специфическая альфанафтилацетатэстераза (Evrev, 1970). Обнаружение ж е ЛДГ-« Х», напротив, является прямым свидетельством присутствия клеток спермы в пятне, д аж е если сперматозоиды разрушены или не выявляются морфологи чески по какой-либо другой причине. Примесь крови или других веществ не препятствует обнаружению ЛДГ-«Х». Фермент удается выявить в пятнах давностью более 35 дней.

Определение ЛДГ-«Х» является существенным дополнением к применяемым в настоящее время методам исследования следов спермы.

Рис. 1 . Ферментативный электрофорез на ацетилцеллюлозной пленке. Сверху — семенная плазма,  снизу — пятно спермы давностью до 36 дней. ЛДГ-«Х» показана стрелкой.

Рис. 2. Ферментативный электрофорез гомогенагов сперматозоидов в полиакриламидном геле. ЛДГ-«Х» показана стрелкой.