Выявление и диагностирование сперматозоидов в семенных пятнах методом люминесценции

Выявление пятен, подозрительных на наличие спермы, и диагностирование истинного происхождения их нередко связано со значительными трудностями.

На практике в целях облегчения поисков сперматозоидов обычно прибегают к их элективному окрашиванию по способу Корэн-Стокиса, причем сперматозоиды окрашиваются в красный цвет, выделяясь на бледно-розовом фоне волокон ткани. Однако эта и другие методики окраски препаратов весьма несовершенны. Сперматозоиды не всегда хорош.0 окрашиваются; сами по себе они чрезвычайно малы и поиски их весьма затруднительны.

В последние годы в судебной медицине начал использоваться ряд новейших физико-технических методик. К их числу, в частности, относится люминесцентное исследование.

Некоторые вещества уже сами по себе способны люминесцировать при воздействии на них ультрафиолетовым или синим светом. Эти же и другие объекты дают особенно интенсивную люминесценцию после предварительной обработки флуорохромами, т. е. специальными веществами, способными люминесцировать под воздействием ультрафиолетовых или синих лучей.

В 1956 г. В. Н. Виноградов и А. К. Туманов предложили использовать для судебнобиологических задач феномен люминесценции головок сперматозоидов при обработке препарата по Корэн-Стокису и затем раствором 1 : 1000 берберин-сульфата, представляющего собой один из специальных флуорохромов.

При рассмотрении таких препаратов под микроскопом в ультрафиолетовом или синем свете наблюдается люминесцентное свечение головок сперматозоидов. Дальнейшее наблюдение соответственно местам обнаруженных светящихся точек проводится при большом увеличении в обычных условиях, что позволяет рассмотреть части сперматозоидов, окрашенных, как уже говорилось, по Корэн-Стокису.

В 1957 г. мы предложили заменить дефицитный берберин-сульфат широко доступным риванолом в растворе 1 : 100; результаты при этом не уступали тем, которые получаются при использовании методики Виноградова—Туманова.

Хотя описанные методики упростили и значительно повысили эффективность поисков сперматозоидов, но они имеют существенный недостаток — отсутствие возможности видеть сперматозоид в целом, что необходимо для диагностирования наличия в пятне спермы.

В связи со сказанным мы поставили перед собой задачу найти мета- дику такой обработки препаратов флуорохромами, при которой выявлялся бы целый люминесцирующий сперматозоид. В результате значительного количества опытов нам удалось решить поставленную задачу.

В качестве объектов исследования использовались вырезки из текстильных тканей с пятнами спермы различной давности — от 2—5 дней до 4 лет. Препараты, соответственно обработанные флуорохромами, изучались через микроскоп МУФ-3 в проходящем ультрафиолетовом (365 мм) и синем свете.

Всего нами было опробовано 19 флуорохромов в разведении 1 : 10 000.

В итоге первого варианта опытов мы остановились на флуорохромах аурамин 00 и акридиновый оранжевый. В обработанных ими препаратах наблюдалась люминесценция всех частей сперматозоида (см. рисунок) желтовато-зеленым — при обработке аурамином 00 и розовым — при применении акридинового оранжевого — цветом. Наличие в исследуемом пятне крови не препятствует проведению люминесцентного исследования, поскольку кровь не гасит люминесценцию сперматозоидов, а лишь несколько ослабляет люминесценцию хвостиков. Для практических задач может быть рекомендована обработка препаратов аурамином 00 как более доказательная. Попутно следует упомянуть, что окраска акридиновым оранжевым была широко использована Штруггером и Хильбрихом при исследовании микроорганизмов бактериального происхождения¹.

Микрофотография люминесцирующих сперматозоидов, обработанных флуоро- хромом аурамин 00. Об. 20, ок. 15.

Мы продолжили наши опыты в направлении окраски препаратов комбинированными флуорохромами, т. е. не одним флуорохромом, а двумя. Второй вариант опытов, как нам представляется, не только дает в руки судебных медиков новый технический прием выявления сперматозоидов, -но, что главное, является новым принципом их дифференциального диагностирования.

При обработке препаратов комбинацией из флуорохромов аура- мин 00 и акридиновый оранжевый головка сперматозоида излучала розовый свет, а хвостик — зеленый.

Такая избирательная люминесценция отдельных частей сперматозоида, несомненно, связана с различием их биохимизма. Таким образом, раздельная избирательная люминесценция двух частей сперматозоида используется в данном случае для диагностики сперматозоида не только по его морфологическим признакам, но и по биохимическим свойствам.

Следует также указать на интересное явление, отмеченное при наблюдении люминесценции сперматозоидов, обработанных аурамином 00 — различную интенсивность люминесценции частей головки, а именно: часть головки, примыкающая к шейке, люминесцирует сплошь и интенсивно; передняя периферическая часть головки дает слабую люминесценцию. Это в свою очередь может служить дифференциальным биохимическим признаком, позволяющим делать вывод о наличии в исследуемом пятне спермы и без обнаружения целого сперматозоида.

Аналогичным методом окраски пользовались Бишоп и Аустин (Endeavour, 1957, т. 16, вып. 63). Авторы применяли люминесцентную микроскопию при исследовании сперматозоидов различных животных (белой крысы, кролика, золотого хомяка, морской свинки, полевого крота и др.), причем употребляли раздельную и комбинированную окраску препаратов флуорохромами: акридиновым оранжевым, родамином 6Г, приму- лином и родамином Б. Однако целевая установка и объем их исследования были иными: они дифференцировали отдельные части живых сперматозоидов, а также применяли метод для отличия мертвых сперматозоидов от живых.

Перейдем к краткому изложению предлагаемой нами методики изготовления препаратов.

Для получения однородной люминесценции объект исследования, например вырезка или соскоб из пятна, подозрительного на наличие спермы, помещают на предметное стекло и пипеткой наносят две капли аура- мина 00 в разведении 1 : 10 000. С помощью препаровальных игл препарат разволокняют. Через 5 минут после обработки флуорохромом препарат накрывают покровным стеклом и высушивают в термостате или над электроплиткой. При сушке нельзя допускать кипения жидкости, находящейся под покровным стеклом. Можно рекомендовать перед нанесением флуорохрома (особенно если пятно покрыто кровью) обрабатывать объект одной каплей 25% раствора аммиака.

Для получения дифференцированной, т. е. раздельной люминесценции головки и хвостика сперматозоидов объект исследования, помещенный на предметное стекло, обрабатывают одновременно 1—2 каплями аурамина 00 и акридинового оранжевого также в разведениях 1 : 10 000. Через 15 минут после нанесения флуорохромов препарат накрывают покровным стеклом. Далее его обрабатывают так же, как и в первом случае. Предварительная обработка аммиаком при этой окраске не рекомендуется.

Наблюдение люминесценции допустимо производить не только через специальный ультрафиолетовый микроскоп, но и при помощи обычною микроскопа и источника синего света, представляющего собой сильный осветитель, например «ОИ-7», снабженный синим светофильтром.

¹ Struger und Hilbrich . Deutsche tierarztliche Wochenschrift, 1942, Bd. 50, H. 11/12.