Обнаружение сурьмы в биологическом материале дробным методом

Дробные методы обнаружения тех или иных веществ занимают все больший удельный вес в аналитической и судебной химии. Желательна разработка дробных методов исследования биологического материала на наличие таких катионов, как сурьма, которые имеют в настоящее время сравнительно небольшое токсикологическое значение, а исследование на них является обязательным, занимая при этом много времени.

Реакций дробного обнаружения сурьмы описано немного. Основным недостатком их является небольшая чувствительность, что отмечают сами авторы, предлагая использовать эти реакции главным образом для обогащения разбавленных растворов.

В настоящее время в аналитической химии широко применяется прием избирательного извлечения тех или иных соединений органическими растворителями, позволяющий в значительной степени повысить специфичность реакций и дающий возможность в то же время увеличить чувствительность и наглядность реакций.

Так, благодаря применению извлечения изопропиловым спиртом комплекса сурьмы с родамином В специфичность этой реакции настолько повышается, что в определенных условиях она может быть применена как дробная. Предложены и другие реакции на сурьму, основанные на том же принципе. Например, извлечение изоамилацетатом комплекса сурьмы с фуксином, извлечение амиловым спиртом слабо заметного в водной среде розовато-оранжевого соединения сурьмы с окисленным цифенил-карбозидом позволяют настолько усилить результат реакции, что окраска органического растворителя принимает яркий малиновый цвет.

За последние годы предложено немало методов определения сурьмы, основанных на извлечении органическими растворителями комплексов сурьмы, образованных ею с основными красителями диаминотри- фенилметанового ряда. Если реакция сурьмы с метиловым фиолетовым в водной среде не является специфичной по отношению к ряду катионов, то извлечение бензолом или толуолом комплексов сурьмы с одним из красителей названного ряда позволяет настолько повысить специфичность этих реакций, что они могут применяться как дробные. Быстрота выполнения реакций и наглядность полученных результатов делают эти реакции особенно ценными.

Экспериментальная часть нашей работы состэит из двух разделов: I) разработка дробных методов обнаружения и определения сурьмы и 2) применение дробных методов обнаружения и определения сурьмы к судебнохимическому анализу биологического материала.

1. Дробные методы обнаружения и определения сурьмы

Основное место мы отвели изучению реакции сурьмы с малахитовым зеленым с целью выяснения условий применения ее при дробном обнаружении сурьмы в биологическом материале.

Для обнаружения сурьмы в биологическом материале ее изолируют из последнего путем минерализации органических веществ серной и азотной кислотами. Для конечного обнаружения и определения сурьмы пользуются сернокислым раствором с большой концентрацией кислоты, содержащим, кроме сурьмы, значительные количества железа¹. Поэтому, изучая реакцию с малахитовым зеленым, мы особенно подробно остановились на влиянии больших концентраций серной кислоты и железа на определение сурьмы.

Согласно указаниям Л. Н. Лапина и В. О. Гейн, реакции на сурьму с малахитовым зеленым по их методике мешают только золото, таллий и железо. Исследование на первые два элемента обычно не производится в ходе судебнохимического анализа, зато железо, будучи естественной составной частью организма человека,.всегда сопутствует при исследовании биологического материала. Правда, авторы метода для освобождения от железа предлагают предварительно осаждать его железисто- или железосинеродистым калием. Однако введение лишней операции осаждения и отделения осадка не является желательным. Поэтому мы сделали попытку устранить влияние железа другим путем, заметив при предварительном изучении, что в присутствии серной кислоты 'Комплекс железа с малахитовым зеленым разрушается очень быстро.

Работа велась нами на точных сернокислых растворах сурьмы. Исходный раствор сурьмы с содержанием ее ! мг/мл готовили растворением металлической сурьмы (спектрально проверенной на чистоту) в горячей концентрированной серной кислоте.

Реакцию на сурьму вели в основном по прописи авторов: к 1 мл исследуемого раствора добавляли 3 мл 5 н. соляной кислоты, 2 капли 5% нитрита натрия, 10—15 капель 0,5% раствора малахитового зеленого (в спирте, смешанном с водой в отношении 1 : 3) —водный слой в присутствии сурьмы окрашивается в оранжевый цвет. При встряхивании полученного раствора с 1 мл толуола или бензола в присутствии сурьмы слой органического растворителя окрашивается в голубой «или синий цвет.

Влияние концентрации серной кислоты изучали параллельно на растворах сурьмы и на растворах двух- и трехвалентного железа (для работы готовили сернокислый раствор железа с содержанием 10 мг железа в 1 мл раствора).

Оказалось, что при обнаружении количеств сурьмы порядка 0,1 мг и выше влияние концентрации серной кислоты заметно не проявляется, но на количествах сурьмы 0,05 мг это влияние бывает резким. При проведении реакции в присутствии 2,5% серной кислоты результат реакции получается отрицательным; с повышением концентрации серной кислоты он все более улучшается; особенно интенсивной становится окраска комплекса сурьмы при добавлении 40% серной кислоты (табл. 1).

Изучение влияния 'концентрации серной кислоты на соли железа показало, что в присутствии 2,5 и 10% серной кислоты окраска комплекса железа вообще не возникает, при 20 и 40% серной кислоте появляется слабая окраска, исчезающая в течение 1—2 минут. Необходимо отметить, что комплекс с двухвалентным железом более устойчив и обесцвечивание его происходит медленнее, чем при трехвалентном железе. При 50% серной кислоте комплекс двухвалентного железа становится более устойчивым и не разрушается уже в течение 2 часов, а в присутствии 70°/о серной кислоты комплексы как двухвалентного, так и трехвалентного железа уже совсем не обесцвечиваются. Однако следует отметить, что окраска комплексов железа настолько слабая, что ни в какое сравнение с окраской сурьмы не может идти, даже в том случае, когда содержание железа превышает содержание сурьмы в 200 раз. Однако, как показали наши опыты, присутствие даже трехвалентного железа совместно с сурьмой вредно влияет на образование комплекса сурьмы, ослабляя его окраску (см. табл. 1).

Таблица 1

Влияние концентрации серной кислоты на стойкость комплексов сурьмы и железа с малахитовым зеленым

Обозначения : + слабо положительная реакция, ++ положительная реакция, + + + резко положительная реакция, + — реакция слабо положительная, но окраска исчезает в течение 1—2 минут.

В литературе мы встретили указания на необходимость добавления хлорида натрия при проведении реакции на" сурьму с малахитовым зеленым и на свойства растворов сульфата натрия высаливать такие комплексы сурьмы, как комплекс ее с ализарином.

Поставленные опыты показали, что добавление до состояния насыщения сухих солей сернокислого натрия или хлористого натрия к исследуемому раствору способствует значительному усилению окраски комплекса сурьмы. Однако одновременно делается более интенсивной и окраска комплекса железа с малахитовым зеленым. Усиление окраски комплекса железа от добавления сульфата натрия незначительно, и исчезновение окраски наблюдается максимально в течение 30—40 минут; в присутствии хлористого натрия окраска комплекса железа значительно усиливается и не исчезает в продолжение 24 часов. Учитывая это обстоятельство, мы в дальнейшем для усиления окраски комплекса сурьмы с малахитовым зеленым пользовались только сульфатом натрия.

При изучении извлекающей способности толуола и бензола по отношению к комплексам сурьмы и железа с малахитовым зеленым выяснилось, что бензол лучше извлекает комплекс железа, чем толуол, а комплекс сурьмы—почти одинаково как тем, так и другим растворителем. Поэтому в дальнейшем для извлечения комплекса сурьмы с малахитовым зеленым мы пользовались только толуолом.

Таким образом, нам удалось разработать применительно к условиям судебнохимического анализа реакцию на сурьму с малахитовым зеленым как дробную, избежав при этом предварительное отделение железа и устранив влияние данного катиона добавлением 20 % серной кислоты при условии извлечения толуолом комплекса сурьмы с малахитовым зеленым. Добавление сульфата натрия позволило к тому же повысить чувствительность реакции, которая даже в присутствии железа (железо: сурьма=200 000: 1) по измененной методике составляет 0,05 у/мл. Реакция в этих условиях специфична по отношению ко всем катионам, имеющим судебнохимическое значение.

В качестве второй подтверждающей реакции на сурьму мы разработали дробную реакцию на нее с тиосульфатом натрия, основываясь на свойстве комплекса сурьмы с ним распадаться при нагревании и давать осадок сульфида сурьмы оранжевого цвета. В применении к биологическому материалу эта реакция может являться дробной, так как железо, всегда присутствующее в биологическом материале, не мешает обнаружению сурьмы благодаря образованию с тиосульфатом бесцветного комплекса, не разлагающегося при нагревании; мешающее влияние меди, которой в 100 г печени может содержаться до 4 мг, устраняется связыванием ее в цианидный комплекс.

Реакцию проводили следующим путем: к 1-—3 мл исследуемого сернокислого раствора добавляли 2 капли 20 % раствора тиосульфата натрия; раствор нагревали до кипения — тотчас или через несколько минут в присутствии сурьмы выпадает осадок оранжевого цвета.

Недостатком этой реакции является ее небольшая чувствительность. Она составляет 0,01 мг/мл. Достоинство ее состоит в чрезвычайной простоте и быстроте выполнения, а также наглядности.

2. Применение дробного метода определения сурьмы к биологическому материалу

Для перенесения разработанных выше дробных реакций непосредственно на биологический материал необходимо было изучить влияние комплекса среды жидкости, получающейся после минерализации органических веществ, установить условия выполнения ее и чувствительность по отношению к биологическому материалу.

С этой целью 100 г печени человека измельчали, смешивали с определенным количеством раствора сурьмы и оставляли на сутки. Затем заливали 75 мл смеси серной и азотной кислот и воды в соотношении 1:1:1. Разрушение органических веществ производили по общепринятой в судебнохимической практике методике. После удаления окислов азота объем минерализата доводили водой до 50 мл.

Установлено, что содержание серной кислоты в жидкости, полученной после минерализации, в объеме 50 мл составляет от 64 до 83%.

Оптимальный объем, который необходимо взять для определения от 50 мл минерализата, — 3 мл. Чтобы исключить влияние железа, необходимо в исследуемом объеме жидкости содержание серной кислоты довести до 40—50°/о. Для этого до проведения реакции с малахитовым зеленым 3 мл минерализата разбавляли 2 мл 20 % серной кислоты, а далее реакцию с малахитовым зеленым проводили, как описано выше.

Выяснилось, что при помощи реакции образования комплекса сурьмы с малахитовым зеленым можно обнаружить минимально 0,1 мг сурьмы в 100 г трупного материала.

Слепые опыты, проводившиеся с каждой серией трупного материала, в этих условиях всегда давали отрицательный результат.

При изучении второй дробной реакции на сурьму с тиосульфатом натрия на биологическом материале было установлено, что для проведения реакции оптимальный объем составляет 3 мл от 50 мл жидкости, полученной после минерализации. До нагревания раствора с тиосульфатом следует добавлять 5—6 капель 10% цианида калия.

Минимальное количество сурьмы, которое возможно обнаружить реакцией с тиосульфатом натрия в 100 г биологического материала, составляет 1 мг.

На проведение двух дробных реакций определения сурьмы в минера- лизате требуется всего 5—10 минут. Таким образом, предложенные дробные реакции обнаружения сурьмы в биологическом материале позволяют к тому же значительно ускорить анализ на сурьму, ибо по общему систематическому ходу исследования на обнаружение сурьмы при судебнохимических исследованиях затрачивается до 12 часов.

Реакция с малахитовым зеленым положена нами в основу количественного колориметрического метода определения сурьмы в биологическом материале.

Разработана следующая методика: 3 мл от 50 мл жидкости, полученной после разрушения 100 г органического вещества, помещают в делительную воронку; туда же добавляют 2 мл 20% серной кислоты, 3 мл 5 н. соляной кислоты, 2 капли 5% раствора нитрита натрия, 15 капель 0,5% раствора малахитового зеленого, 0,1—0,2 г сульфата натрия и 5 мл толуола. Смесь энергично встряхивают в течение 1—2 минут, и толуол отделяется от водного слоя. Если окраска водного слоя ослабла, то вновь добавляют несколько капель малахитгового зеленого до возвращения оранжевой окраски и снова извлекают 5 мл толуола. Извлечение толуолом повторяют до тех пор, пока слой последнего не будет окрашиваться в голубой цвет при наличии оранжевой окраски водного слоя. По окончании извлечения все порции толуола сливают вместе и объем жидкости доводят с помощью толуола до определенного минимального объема (обычно 10—20 мл).

Таблица 2

Количество сурьмы, определяемой колориметрическим методом, в трупном материале

 При больших количествах сурьмы (1—10 мг), когда окраска толуола слишком интенсивна, определенный объемизвлечения разбавляют перед колориметрированием до желаемой плотности раствора. Колориметрирование производят визуально или с помощью фотоколориметра. При визуальном колориметрировании шкалу готовят в интервале от 0,0001 до 0,01 мг/мл толуола через один интервал. Для этого перед колориметрированием готовят стандартный раствор с содержанием 0,01 мг/мл толуола, для чего 1 мл точного сернокислого раствора сурьмы с содержанием 0,05 мг сурьмы извлекают толуолом по описанной выше методике, и раствор доводят в мерной колбе на 50 мл толуолом до метки.

При определении сурьмы в биологическом материале (печени человека) с применением данного метода получены вполне удовлетворительные результаты (табл. 2).

В основном в биологическом материале нам удавалось определять 100% сурьмы, введенной в'биологический материал, но при малых количествах сурьмы — от 0,1 мг до 1 мг — результаты определения иногда были заниженными до 66—80%.

Как показали наши опыты, эти заниженные цифры не относятся к потерям сурьмы за счет операции разрушения органических веществ, так как при определении этого катиона, добавленного к минерализату, полученному после разрушения биологического материала, не содержащего его, результаты количественного определения были теми же. Предложенный метод количественного определения сурьмы в биологическом материале позволяет быстро и с достаточной точностью определять сурьму в том же минерализате, в котором производилось качественное обнаружение этого катиона.

Выводы

1. Предложены две реакции для дробного обнаружения сурьмы в биологическом материале. Реакции позволяют быстро и с достаточной точностью производить обнаружение сурьмы. Определяемый минимум основной реакции образования комплекса с малахитовым зеленым составляет 0,1 мг сурьмы в 100 г печени.
2. Разработан колориметрический метод определения сурьмы в биологическом материале. Метод дает возможность определять 100% сурьмы в биологическом материале при содержании ее от 1 мг и выше и от 66 до 100% при содержании ее в количествах от 0,1 до 1 мг в 100 г биологического материала.

¹ В 100 г печени человека содержится от 100 до 150 мг железа.