Определение групповой принадлежности микрофрагментов волос с помощью реакции абсорбции-элюции с использованием моноклональных антител

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКИЙ ЦЕНТР СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГРУППОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ МИКРОФРАГМЕНТОВ ВОЛОС С ПОМОЩЬЮ РЕАКЦИИ АБСОРБЦИИ-ЭЛЮЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

(Усовершенствованная медицинская технология)

Москва

РИО ФГУ РЦСМЭ
Минздравсоцразвития России

2009

Аннотация

Усовершенствованная медицинская технология определения групповой принадлежности микрофрагментов волос с помощью реакции абсорбции-элюции с использованием моноклональных антител (МКА) позволяет устойчиво выявлять АВН антигены во фрагментах стержней волос длиной не более 10-15 мм. Включает в себя методику пробеподготовки стержня волоса, подготовку специфического реагента на основе МКА, модификацию реакции абсорбции-элюции с учетом биохимических и структурных особенностей стержня волоса.

Усовершенствованная медицинская технология предназначена для использования врачами судебно­ медицинскими экспертами биологических отделений Бюро судебно-медицинской экспертизы.

Организация-разработчик: ФГУ РЦСМЭ Росздрава, 125284, г. Москва, ул. Поликарпова, д. 12/13; Институт криминалистики ЦСТ ФСБ России, 101000, Москва.

Авторы: доктор медицинских наук М.И. Лапенков, В.Ю. Александрова, доктор медицинских наук, профессор Р.С. Сахаров, С.В. Гуртовая, Т.А. Капинос, к.б.н. В.К.Смирнова.

Введение

«Определение групповой принадлежности микрофрагментов волос с помощью реакции абсорбции-­элюции с использованием моноклональных антител» является усовершенствованной медицинской технологией.

Включение этапа прогревания волоса на водяной бане в ходе проведения пробеподготовки приводит к значительному усилению выраженности специфической реакции. Внесение неиониого детергента твин 20 в рабочий раствор антител предотвращает появление неспецифических взаимодействий.

Благодаря данным изменениям применение настоящей методики по сравнению с предшествующей способствует повышению надежности определения групповой принадлежности волос, особенно в случае поступления для экспертного исследования фрагмента незначительной длины и при типировании волос от лиц со слабыми вариантами антигенесистемы АВО.

Показания к использованию усовершенствован.ной медицинской технологии

Методика установления групповой принадлежности волос может быть использована при судебно-медицинском исследовании волос человека или их фрагментов, которые часто фигурируют в качестве вещественных доказательств при расследовании разнообразных преступлений.

Противопоказания к использованию усовершенствованной медицинской технологии

Не выявлены.

Материально-техническое обеспечение медицинской технологии

Оборудование и реактивы, стандартные для судебно-биологических лабораторий бюро судебно­медицинской экспертизы.

Описание усовершенствованной медицинской технологии

Пробаподготовка образцов.

Волос промывают теплой мыльной водой, используя  72%-ное хозяйственное мыло и ополаскивают дистиллированной водой. Отрезают фрагмент волоса. При  определении необходимой длины фрагмента учитывают, что для выявления антигена А требуется не менее 4 мм длины стержня волоса, для выявления антигенов В и Н - не менее 2 мм. Волос помещают в микроцентрифужную пробирку с деионизированной водой и выдерживают на кипящей водяной бане в течение 20 мин. Такая процедура способствует проникновению антител вглубь стержня волоса и препятствует возникновению неспецифических процессов. Исследование следует проводить в тот же день, так как использование подготовленного таким образом волоса в РАЭ в последующие сутки или в более поздние сроки может привести к неспецифичским реакциям.

Волос раздавливают стекляной пробиркой на предметном стекле до состояния «белой пластинки» (волос при раздавливании приобретает более светлый цвет, что хорошо заметно на черном фоне) и делят на необходимое количество частей.

Ход работы.

Исследование проводят с помощью МКА. Можно использовать антитела производства 000 «Гематолог» (ГНЦРАМН).

В лунки планшета для иммунологических реакции вносят по 50 мкл рабочих растворов антител, содержащих неионный детергент твин 20 (до конечной концентрации 0,6% по объему), затем помещают по одному фрагменту волоса. Абсорбцию проводят в течение 18-24 ч при температуре 4-6°С.

Фрагменты волос отмывают от непрореагировавших антител охлажденным до 4°С фосфатно-солевым буфером 0,1 М, рН 7,4 (ФСБ). Состав ФСБ: NCl - 8.0 г, К₂PO₄ - 0.2 г, Na₂HPO₄ х 12Н₂О - 2.8 . г, KCl - 0.2 г, деионизированная вода - до 1 л. Фрагменты волос, которые инкубировали в раствор анти-А антител промывают последовательно в трех лунках; оптимальная общая продолжительность отмывки - 10-20 мин. Фрагменты волос, которые инкубировали в растворе анти-В и анти-Н антител, промывают последовательно в шести лунках; оптимальная общая продолжительность отмывки - 60 мин. Волосы высушивают на фильтровальной бумаге.

Отрезки биологически инертной клейкой ленты размером около 10×10 мм помещают на предметные стекла на капли дистиллированной воды липким слоем вверх. Фрагменты волос переносят на липкий слой. На фрагменты волос, фиксированные на липкой ленте, наносят по 30 мкл соответствующих тест-­эритроцитов и стекла помещают во влажную камеру. Абсорбованные антитела анти-В и анти-Н элюируют в 0,15% взвесь тест-­эритроцитов группы А в ФСБ. Абсорбированные антитела анти-А элюируют в 0,15% взвесь тест­эритроцитов групы в ФСБ, содержащим 0,5%-1% БСА. Температура элюции - 48-50°С; продолжительность - 30 мин.

После окончания элюции фрагменты волос на липких лентах накрывают покровным стеклом и фиксируют наличие агглютинации с использованием микроскопа.

Достоверным считается двукратно подтвержденный результат.

Возможные осложнения при использовании медицинской технологии и способы их устранения

Не выявлены.

Эффективность использования усовершенствованной медицинской технологии

Усовершенствованная медицинская технология позволяет выявлять антигены АВН в стержне волос, в том числе в микрофрагментах длиной 1,5-2,0 см, давностью, по крайней мере, 10 лет. Типирование волос двумя наборами МКА разных производителей при совпадении результатов, сводит вероятность ошибки к минимуму.

Всего исследовано 126 волос от лиц с известной группой крови по системе АВО, а также образцы волос от 47 лиц, проходивших по уголовным делам, группа крови которых была установлена по образцам крови. Все волосы были типированы корректно. Только в двух случаях не удалось выявить антиген А в волосах от известных лиц со слабыми формами данного антигена и сроком давности отбора образцов волос 5 и 7 лет.