Установление наличия спермы на вещественных доказательствах по кислой фосфатазе колориметрическим методом: методические рекомендации

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «РОССИЙСКИЙ ЦЕНТР СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ «БЮРО СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ»

«Утверждаю»
И.о. директора ФГБУ «РЦСМЭ» Минздравсоцразвития России,
доктор медицинских наук

А.В. Ковалев

29 марта 2012 г.

УСТАНОВЛЕНИЕ НАЛИЧИЯ СПЕРМЫ НА ВЕЩЕСТВЕННЫХ ДОКАЗАТЕЛЬСТВАХ ПО КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЕ КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

(Методические рекомендации)

Москва 2012

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время в практике работы судебно- биологических отделений БСМЭ для предварительного (ориентировочного) установлении наличия спермы в следах и участках на вещественных доказательствах применяют фитоагглютинационный способ (реакцию с картофельным соком) и реакцию на общую кислую фосфатазу (КФ) с применением тестирующих полосок «Phosphatesmo КМ».

В зарубежной судебно-медицинской практике для этих целей используются  высокочувствительные колориметрические методы в различных модификациях (Allery J.P., et al., 2003; Albrecht К., Schultheiss D, 2005; Gorzkiewich M., et al., 2008; Evers H., et al., 2009; Laux D.L., 2011; Romero- Montoya L., et al., 2011), которые основаны на измерении оптической плотности окрашенных продуктов реакции: сравнивается интенсивность окраски исследуемого раствора с окраской стандартного раствора, концентрация которого известна.

Для ориентировочного установления наличия спермы в следах и участках на вещественных доказательствах по КФ нами был разработан усовершенствованный вариант колориметрического     метода с использованием диагностического тест-набора «ACID PHOSPHATASE (АСР)» фирмы «BioSystems» (Испания), который применяются в клинической практике для определения общей и простатической КФ в сыворотке крови человека с целью диагностики простатита, аденомы и рака предстательной железы.

Принцип метода заключается в том, что субстрат 1-Нафтил фосфат гидролизуется КФ и переходит в 1-Нафтол, который преобразуется в устойчивый комплекс и способен к окрашиванию. При измерении оптической плотности окрашенного комплекса, увеличение абсорбционной способности при длине волны в 405 нанометров пропорционально активности общей кислой фосфатазы в исследуемом образце. Простатическая КФ блокируется гартратом и может быть определена путем вычисления разности в активности общей КФ и активности КФ, оставшейся после подавления простатической КФ ингибитором (тартратом). По инструкции, прилагаемой к набору, измерение оптической плотности рекомендуется проводить в кварцевых кюветах посредством спектрофотометра. Нами же предложено производить измерения в 96 луночных прозрачных полистирольных планшетах с плоским дном с помощью медицинского микропланшетного ридера «Sunrise» фирмы «TECAN Austria GmbH» с программным обеспечением «Magellan» при длине волны 405 нм, что значительно увеличивает производительность данной методики.

Преимущество этого метода перед широко распространенными в настоящее время в судебно- медицинской практике ориентировочными методиками определения КФ на вещественных доказательствах, состоит в том, что он позволяет отделить простатическую КФ от общей КФ. Общая КФ может быть обнаружена на вещественных доказательствах за счет присутствия на них слюны, влагалищных выделений, крови, сока растений, а также за счет загрязнения их бактериальными ферментами. Простатическая же КФ содержится только в сперме. Предложенная нами технология обладает более высокой производительностью и большей специфичностью: положительный результат (наличие простатической КФ) может быть получен, как правило, только со спермой. Объективный и количественный учет результатов, с последующей компьютерной обработкой данных, позволяет хранить их на жестком диске или других носителях, а также при необходимости распечатывать и иллюстрировать Заключение эксперта. Кроме того, преимущество методики в ее значительной производительности и экономичности.

Показания к использованию метода

Колориметрический метод обнаружения спермы на вещественных доказательствах посредством выявления КФ может быть применён как при судебно-медицинском исследовании крупногабаритных вещественных доказательств без видимых глазом следов (постельное белье, верхняя одежда, различные предметы и т. п.), так и тампонов с содержимым влагалища, полости рта и прямой кишки.

МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ

96-луночные прозрачные полистирольные планшеты с плоским дном. Набор реагентов для колориметрического определения общей и простатической кислой фосфатазы в сыворотке крови человека «ACID PHOSPHATASE (АСР)» фирмы «BioSystems» (Регистрационное удостоверение № ФСЗ 2008/01122 от 29 февраля 2008 г.), используемый в клинической практике для диагностики заболеваний предстательной железы.

Встряхиватель (шейкер от англ.- shake грясти) - термостатируемый серии ST-3 фирмы «Елми Лтд» (Регистрационное удостоверение Минздрава РФ №96/636 от 04.09.1996 г.).

Набор реагентов для колориметрического определения общей и простатической кислой фосфатазы в сыворотке крови человека «ACID PHOSPHATASE (АСР)» фирмы «BioSystems» (Регистрационное удостоверение № ФСЗ 2008/01122 от 29 февраля 2008 г.), используемый в клинической практике для диагностики заболеваний предстательной железы.

Ридер (от англ. read - читать, считывать) - аппарат для фотометрического учета результатов реакции медицинский микропланшетный «Sunrise» фирмы «TECAN Austria GmbH» с программным обеспечением «Magellan» (Регистрационное удостоверение МЗ РФ №2003/829 от 22.05.2003 г.)

ОПИСАНИЕ МЕТОДА

Пробоподготовка образцов

Вырезают фрагмент из объекта размерами 0,5x0,5 см, либо несколько вырезок из участка размерами 10x10 см, подозрительного на присутствие спермы, а при необходимости и контрольного участка предмета-носителя (в зависимости от тактики экспертного исследования, характера и величины следов), на котором требуется установить наличие спермы, заливают минимальным необходимым (без избытка) объемом дистиллированной (лучше деионизированной) воды с Ph=7,2-7,4 (соответствует Ph сыворотки крови человека). Экстрагируют при температуре 4° С от 18 до 24 часов.

В качестве положительного контроля можно использовать экстракты из высушенной на марле спермы человека в разведении 1:100 и 1:1000. Отрицательный контроль - жидкая слюна человека в разведении 1:2; 1:1. Данный отрицательный контроль позволяет убрать влияние слюны и влагалищных выделений, в которых может содержаться незначительное количество общей КФ, а также частично влияние простатической КФ сыворотки крови при исследовании насыщенных кровяных пятен. Он готовится таким образом, чтобы его оптическая плотность при измерении составляла 0,05-0,06 условных единиц.

Ход работы

Данный метод реализуется в следующей последовательности действий (рис. 1):

• - приготовление отрицательного контроля (жидкая слюна в разведении 1:2; 1:1) и положительного контроля (вытяжка из высушенной на марле спермы, разведенная 1:100, 1:1000);
• - внесение в лунки Al и Bl полистирольной планшеты с плоским дном по 10 мкл отрицательного контроля, а в лунки О и D1 по 10 мкл положительного контроля. Внесение во все остальные лунки (по порядку) по 10 мкл исследуемых вытяжек;
• - внесение во все занятые контролями и исследованным материалом лунки по 100 мкл буфера на общую КФ из набора «ACID PHOSPHATASE (АСР)» фирмы «BioSystems» (Испания). Буфер готовится по инструкции, приложенной к данному набору
• - инкубация в течение 3-5 минут на шейкере-термостате при температуре +37° С (интенсивность перемешивания 600- 650 об/мин);
• - регистрация результатов реакции фотометрически на ридере при длине волны 405 нм с трех минутным интервалом (кинетика), введение результатов в компьютер;
• - распечатка результатов с помощью принтера;
• - проверка вытяжек, в которых получены положительные результаты на присутствие общей КФ, на наличие ингибиции с тартратом. В лунки полистирольного планшета вносят по 10 мкл вытяжек. Затем в вышеуказанные лунки вносят по 100 мкл буфера, содержащего тартрат, приготовленного по инструкции. Затем инкубируют на шейкере и снимают показания на ридере, как было описано выше. Если фосфатаза в исследуемых вытяжках простатическая, а не общая, то мы будем наблюдать выраженную ингибицию (значение оптической плотности с тартратом будет в 3-10 раз меньше, чем с буфером, предназначенным для измерения общей КФ).
• - исследование материала, в котором обнаружена простатическая КФ, доказательными методами на наличие спермы: морфологическими (поиск целых сперматозоидов или их головок) или иммунохроматографическими (обнаружение простатоспецифического антигена или семиногелина человека).

Рис. 1. Схема проведения анализа

Оценка результатов

Компьютерную программу для ридера (программное обеспечение продается вместе с прибором, под каждый тест- набор пользователь сам или с помощью инженера- программиста составляет программу, исходя из инструкции к нему) следует написать так, чтобы отсечка (начало учета положительного результата) шла от значения в 1,5 большего средней оптической отрицательных контролей. Принцип подсчета и обработки результатов реакции заключается в следующем: исходят из отрицательных контролей, находящихся в лунках Al и Bl (жидкая слюна человека, разведенная 1:1 или 1:2). В данных лунках определяют оптическую плотность, которая должна находиться в пределах 0,05-0,06 условных единиц, после чего полученные значения усредняются (складываются и делятся пополам) и умножаются на 1,5 (это осуществляется на компьютере с помощью программного обеспечения. Вышеуказанная процедура служит основой для последующего определения положительного, либо отрицательною результата в исследуемых пробах, полученных с объектами на вещественных доказательствах. Положительный контроль (вытяжки из высушенной на марле спермы человека, разведенные 1:100, либо 1:1000), в котором должны быть достаточно большие показатели оптической плотности (0,5-2,5) указывает на то, что методика работает правильно. Следовательно, все, что больше или равно усредненным отрицательным контролям, умноженным на 1,5 по значению оптической плотности должно отмечаться как (+), а все что меньше - как (-). Таким образом, если при исследовании вытяжки из исследуемого объекта на вещественном доказательстве получен положительный результат «+», то это свидетельствует о присутствии либо общей, либо простатической КФ на данном вещественном доказательстве (их разделяют путем дальнейшего исследования).

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА

Метод апробирован на заведомых образцах спермы человека, высушенной на марле, при этом была установлена достаточно высокая чувствительность метода (не уступает «Phosphatesmo КМ»). При использовании данного метода частично устраняется влияние крови, и практически полностью влияние бактериальных ферментов, сока растений, влагалищного секрета, слюны и других выделений на результаты реакции, за счет эффективно подобранных отрицательных и контролей и возможности отделения простатической КФ от общей КФ. По сравнению с традиционно применяемыми для судебно-медицинского исследования методиками установления ориентировочного наличия спермы в пятнах и тампонах, обнаружение КФ колориметрическим методом обладает целым рядом существенных преимуществ:

1. Более высокая специфичность в сочетании с объективной регистрацией и возможностью компьютерной обработки результатов. Документирование результатов реакции в табличной форме позволяет дополнительно иллюстрировать заключения экспертов.
2. Достаточно высокая экономичность метода, связанная с меньшей стоимостью реагентов по сравнению с импортными тест-полосками «Phosphatesmo КМ» (в 4-5 раз).
3. Высокая технологичность и производительность метода (можно исследовать до 190 объектов одновременно).

Данный метод был апробирован в Бюро СМЭ Санкт- Петербурга на 2400 объектах, было проведено 68 судебно- биологических экспертиз. В ходе проведения экспертных исследований данной методикой в пятнах, следах и участках на вещественных доказательствах неоднократно были получены положительные результаты (обнаружена КФ). При дальнейшем исследовании в подавляющем большинстве положительных проб были найдены сперматозоиды или были выявлены простатоспецифический антиген и семиногелин человека.

ЛИТЕРАТУРА

1. Allery J.P., Telmon N., Blanc A., Mieusset R., Rougu D. Rapid detection of sperm: comparison of two methods // J. Clin. Forensic Med. 2003. - Vol. 10, № 1. - P. 5-7.
2. Albrecht K., Schultheiss D. Sperm stains in legal medicine. An historical review of forensic authentication methods // Urologe A. - 2005. - Vol. 44, № 5. - P. 530-539.
3. Gorzkiewicz M., Wouniak M., Grzybowski Т., Juczak S., Linkowska K., Daca P. Identification of semen in bloodstains with the use of alternative light source and biochemical screening tests // Arch. Med. Sadowej Kryminol. - 2008. - Vol. 58, № 4. - P. 182- 187.
4. Evers H., Heidorn F., Gruber C., Lasczkowski G., Risse M., Dettmeyer R., Verhoff M.A. Investigative strategy for the forensic detection of sperm traces // Forensic Sci. Med. Pathol. - 2009.-Vol. 5, № 3. P. 182-188.
5. Laux D.L. Development of biological standards for the quality assurance of presumptive testing reagents. Sci. Justice. - 2011.-Vol. 51, №3.- P. 143-145.
6. Romero-Montoya L., Marthnez-Rodrhguez H., Pirez M.A., Argello-Garcha R. Relationship of spennatoscopy, prostatic acid phosphatase activity and prostate-specific antigen (p30) assays with further DNA typing in forensic samples from rape cases // Forensic Sci. Int. - 2011. - Vol. 20; 206, № 1-3. - P. 111-118.