Обнаружение атропина в биологических объектах с применением метода хроматомасс-спектрометрии (случай из практики)

В последние годы, в период август-сентябрь регистрировались случаи поступления военнослужащих по призыву с признаками отравления атропиноподобными веществами.

Именно август-сентябрь совпадает с периодом созревания плодов растений, содержащих атропин и родственные с ним алкалоиды. К таким растениям относятся белладонна или красавка (Atropa belladonna), дурман обыкновенный (Datura stramonium) и белена чёрная (Hiosciamus niger). Причём ядовиты не только семена, но и другие части растений (корень, листья), из-за содержания в них алкалоидов – атропина, гиосциамина и скополамина. Алкалоиды  этих растений обладают выраженным парасимпатиколитическим действием. Атропин в больших дозах оказывает на центральную нервную систему возбуждающее действие, вплоть до нарушения способности ориентироваться в пространстве, появления галлюцинаций, делирия и судорог. Возбуждающее действие наиболее выражено при отравлении белладонной. Дурман, известный во Франции под названием колдовской и дьявольской травы, так же вызывает самые фантастические галлюцинации и буйный делирий. Именно эти одурманивающие эффекты послужили причиной злоупотребления белладонной и дурманом.

Так как город Хабаровск и Хабаровский край входят в ареал распространения вышеуказанных растений, случаи отравления ими не редки. Поэтому встаёт вопрос о надёжной, высокочувствительной и достаточно быстрой методике определения атропина в биологических жидкостях.

Как правило, процедура токсикологического анализа включает в себя два основных этапа: скрининговые исследования и подтверждающий анализ.  На первом этапе исследований хорошо зарекомендовал себя метод восходящей тонкослойной хроматографии на готовых хроматографических пластинках «Сорбфил». Подтверждение полученных результатов возможно различными методами. Нами был применён метод газовой хроматографии с масс-селективным детектором (ГХ-МСД). В связи с тем, что в доступной специальной литературе чётких условий проведения ГХ–МСД  анализа на атропин мы не встретили, а возможности газовых хроматографов с МСД позволяют высокую вариабельность программирования параметров метода, мы подобрали условия анализа, позволяющие эффективно обнаружить атропин.

Приготовленные высушенные экстракты из биологических жидкостей (экстрагировали хлороформом при рН 9-10 из крови, предварительно разбавленной дистиллированной водой 1:1 и мочи) растворяли в 0,5 мл метанола, переносили в виалы и исследовали на аналитическом оборудовании: хроматографе Agilent  6890N с масс-селективным детектором Agilent 5973N фирмы Agilent Technologies (USA). Колонка HP–5MS длиной 30 м,  с внутренним диаметром 0,25 мм. Газ-носитель – гелий, скорость газа-носителя в колонке - 1,0 мл/мин.  Режим без деления потока. Начальная температура колонки 70 °С, выдержка 3 минуты, затем подъём температуры до 280 °С со скоростью 20 град/мин. Выдержка при конечной температуре колонки 3 мин. Температуры: инжектора – 280°С, интерфейса детектора – 290°С, соответственно.

Масс-спектрометр работал в режиме сканирования спектров электронного удара при  70 эВ диапазоне от 31 до 550 дальтон. Анализ проводили в режиме сканирования по полному ионному току. «Задержка на растворитель» время включения катодов и анализатора: через три минуты после ввода пробы. Диапазон масс: m/z 41-550 а.е.м. Напряжение на умножителе: результат, полученный при автоматической настройке по перфторбутиламину в режиме ATUNE.

Анализ полученных хроматографических данных проводили с использованием программного обеспечения  «Hewlett-Packard G1540N MS ChemStation» и масс-спектрометрических баз данных библиотек WILEY 7 N,  NIST 02, PMW-TOX 3, предоставленных фирмой-производителем. Хроматографический поиск осуществляли методом ручной обработки хроматограмм, а так же с применением стандартной системы поиска АМDIS.

При исследовании экстрактов из крови и мочи был обнаружен атропин (время удерживания 13.50), вероятность совпадения его масс-спектра с библиотечными данными # 69 Atropine составляла более 80 % . Наиболее интенсивный ион - 124, другие характеристические ионы - 82,83, 140, 289. Время анализа - 19,5 минут. Ниже на рисунках № 1 и 2, в качестве примера, представлены хроматограмма исследуемого экстракта мочи по полному ионному току и масс-спектр обнаруженного атропина.

Рис. 1. Хроматограмма экстракта мочи по полному ионному току.

Рис. 2. Масс-спектр обнаруженного атропина (atropine) в сравнении с библиотечным масс-спектром.

Проведение ГХ-МСД анализа при предложенных нами параметрах метода позволило надёжно идентифицировать пик атропина, что дало возможность подтвердить предполагаемый диагноз.