К определению агглютиногенов изосерологической системы AB0 в волосах

Определение групп изосерологической системы АВО в волосах с целью установления их сходства имеет большое значение для судебномедицинской экспертизы. Оно может помочь разрешить вопрос о возможности принадлежности волос, обнаруженных на месте происшествия, подозреваемому, потерпевшему или другому лицу; кроме того, в связи с тем что волосы длительно сохраняются, установление их групповой принадлежности позволяет судить о групповой принадлежности разложившегося или скелетированного трупа.

Однако полной ясности в методике выявления групповых признаков волос в настоящее время еще нет.

Креффт (Krefft, 1953) и Тесарж (Tesaf, 1954) проводили реакцию торможения агглютинации с вытяжками из измельченных волос (навески по 100 мг), причем Креффт считал свои результаты удовлетворительными, а Тесарж полагал, что к результатам такого исследования следует относиться с осторожностью.

Берг (Berg, 1957), повторив методику Креффта, получил отрицательные результаты.

Тома (Thoma, 1954) выявлял групповые факторы в волосах и ногтях, повышая проницаемость объектов ультразвуком.

Реакцию абсорбции агглютининов в количественной модификации с механически измельченными волосами производили Р.Г. Геньбом и Н.П. Корнеева (1958) с навесками в 50 и 25 мг; JI. Г. Бирюкова (I960) с навесками в 50, 25 и 10 мг. Эти авторы получили хорошие результаты, причем Л.Г. Бирюкова впервые отметила весьма интересный факт, что волосы «слабых выделителей» группы В обладают способностью довольно значительно ослаблять и титр сыворотки а, что может повлечь за собой экспертные ошибки.

Тем же методом с вытяжками из измельченных волос, соответствовавшими по объему навескам в 25 мг, работал Фьори (Fiori, 1960), но он считает свои результаты недостаточными для применения этого метода на практике.

Г.А. Прейсман (1957) растворял кератин неизмельченных волос раствором едкого натра в концентрации 1:1000 и, применяя собственный вариант количественной модификации реакции абсорбции агглютининов, получал хорошие результаты.

Поццато и Молла (Pozzato е Molla, 1960) проводили указанную реакцию с проксимальными концами неизмельченных волос (навески в 20—30 мг) и с вытяжками, полученными дихлорэтиленом и бензолом (навески волос в 30—60 мг). По мнению этих авторов, описываемыми ими методами пользоваться в практике нельзя.

Учитывая, что наиболее доступный способ измельчения волос — механический — требует большой затраты времени и физических сил и связан со значительной потерей материала при растирании, было решено искать другие пути проникновения внутрь кератиновых образований (в частности, химический способ).

В работах Александера (Alexander, 1949, 1950, 1951) указывается, что горячие растворы бромистого лития в концентрации 50% и выше разрушают водородные связи кератина и тем самым как бы «расслабляют» кератиновые структуры. Это объясняется тем, что ион Li 1+ является (за исключением протона) самым малым по размерам катионом; он обладает весьма большой поляризующей силой и очень высоко гидратируется, поэтому в концентрированных растворах, в которых количество молекул воды недостаточно для полной гидратации иона Li1+ , эти ионы координируются с имидными группами кератина, нарушая его водородные связи и повышая, таким образом, проницаемость кератиновой оболочки.

На основании этих работ Ротмен и Ташджиян (Rothman and Tashdjian, 1951) с успехом применяли горячие растворы бромистого лития в концентрациях 50, 75 и 100% для .лечения микозов (облегчалось проникновение фунгицидов внутрь волоса). В 1953 г. Ротмен использовал указанные растворы бромистого лития при лечении грибковых заболеваний ногтей.

Исходя из этих данных, мы решили применить бромистый литий для предварительной обработки волос в процессе определения их групповой принадлежности.

В первую очередь мы выясняли, не влияет ли раствор бромистого лития на гемагглютинирующие сыворотки, причем оказалось, что при добавлении 50% раствора бромистого лития к гемагглютинирующим изо- и иммунным сывороткам они полностью или почти полностью теряют способность агглютинировать соответствующие стандартные эритроциты. Отсюда следовало, что перед проведением реакции абсорбции агглютининов бромистый литий нужно тщательно устранять из исследуемого материала. Для этого навески волос, обработанные бромистым литием, отмывали физиологическим раствором, причем наилучшие результаты дало трехкратное отмывание, сопровождавшееся центрифугированием по 3 1 /2 минуты при 3000 об/мин.

Целью предварительных опытов был выбор оптимальных условий для обработки волос бромистым литием в отношении температурного режима, концентрации раствора бромистого лития и срока обработки, а также техники проведения и учета результатов реакции абсорбции агглютининов в количественной модификации. Оказалось, что наилучшие результаты дает обработка волос 50% раствором бромистого лития при 98° в течение часа. Оптимальным при исследовании волос оказался титр сывороток 1 : 16, а наилучшим способом титрования—развернутое (не в кратных, а в смежных разведениях). Абсорбция длилась 24 часа при температуре 4°. Учет результатов реакции производили титрованием, причем разведения абсорбированных и исходных сывороток делали в пробирках, а реакцию агглютинации осуществляли на плоскости (фарфоровые, тарелки) при наблюдении с лупой в условиях яркого электрического освещения.

Основные опыты заключались в следующем: неизмельченные волосы тщательно отмывали горячей водой с мылом, трижды промывали чистой горячей водой, просушивали фильтровальной бумагой, обезжиривали в двух порциях эфира (в течение часа в каждой) и вновь просушивали. Затем делали навески волос; вначале применяли навески по 50 мг, а затем, учитывая, что при судебномедицинских экспертизах в качестве вещественных доказательств фигурирует обычно очень малое количество волос, навески постепенно уменьшали до 25, 10 и, наконец, до 5 мг. Каждую навеску волос, помещенную в агглютинационные пробирки, заливали 1 мл свежеприготовленного 50% раствора бромистого лития, после чего производили предварительную обработку и проводили реакцию абсорбции агглютининов с соблюдением приведенных выше условий. Сыворотки добавляли к навескам волос в следующем объеме: к навескам в 50 мг — 0,3 мл, в 25 мг — 0,15 мл, а к навескам в 10 и 5 мг, в связи с тем что для развернутого титрования нужно не менее 4 капель сыворотки,—по 0,1 мл. Применяли как изосыворотки Р и а, так и иммунные сыворотки анти-О(Н) , анти-В и анти-А.

Были исследованы волосы 43 человек, из них 10 образцов волос лиц группы 0(1), 14 —группы А(II), 14 — группы В (III) и 5—группы AB(IV); 36 человек относились к категории «выделителей» групповых веществ, а 7 были «слабыми выделителями».

Волосы лиц группы 0(1). 9 образцов «выделителей» агглютиногена 0 и один образец «слабого выделителя». Групповую принадлежность волос «выделителей» в навесках в 50, 25 и 10 мг удалось определить при абсорбции в течение 24 часов во всех случаях, а в навеске в 5 м г — в 8 случаях из 9; в одном случае для получения с этой навеской отчетливых результатов пришлось продлить абсорбцию до 48 часов.

В волосах «слабого выделителя» агглютиноген 0 удалось обнаружить в навесках в 50, 25 и 10 мг; в навеске в 5 мг этот агглютиноген не выявился даже при длительной абсорбции (48 часов).

Волосы лиц группы А (II). 12 образцов «выделителей» агглютиногена А и 2 образца «слабых выделителей». Группа волос «выделителей» была установлена во всех образцах, при этом в навесках в 50, 25 и 10 мг абсорбция в течение 24 часов оказалась достаточной во всех случаях, а в навеске в 5 м г — в 9 случаях из 12; положительные результаты в остальных 3 случаях были получены с этой навеской при увеличении срока абсорбции до 48 часов.

В волосах «слабых выделителей» агглютиноген А в одном случае был определен в навесках в 50, 10 и 5 мг; присутствие его в навеске в 25 мг не было доказано вследствие значительного связывания разноименного агглютинина (в этой навеске группу данного образца удалось выявить при помощи иммунных сывороток). Во втором случае групповая принадлежность по вышеуказанной причине не была определена ни в одной навеске.

Волосы лиц группы В(III). 9 образцов «выделителей» агглютиногена В и 4 образца «слабых выделителей». Во всех образцах волос «выделителей» групповая принадлежность была установлена в навесках в 50, 25 и 10 мг при сроке абсорбции 24 часа, а в навеске в 5 мг — в 8 образцах из 9; в одном случае в навеске в 5 мг группу не удалось определить даже при абсорбции в течение 48 часов.

В волосах «слабых выделителей» удалось установить групповую принадлежность только в одном образце из 4 в навеске в 25 мг (в остальных навесках этого образца группа не была определена вследствие малой степени специфической абсорбции) и в одном образце в навеске в 5 мг. Во всех других случаях выяснению групповой принадлежности волос «слабых выделителей» препятствовало значительное связывание разноименного агглютинина.

Кроме того, имелся еще один образец волос «выделителя» группы В, при определении группы которого были получены неудовлетворительные результаты: наряду с относительно слабой абсорбцией агглютинина β наблюдалось довольно значительное связывание агглютинина а, иногда даже превышавшее специфическое.

Эти результаты, сходные с теми, которые были получены при установлении групповой принадлежности волос «слабых выделителей», противоречили остальным данным. В дальнейшем выяснилось, что человек, у которого были взяты волосы, хотя и является «выделителем», но в его выделениях агглютиноген В выражен довольно слабо, чем, очевидно, и объясняются полученные в отношении этого образца волос данные.

Лишь в навеске волос в 10 мг неспецифические явления оказались слабо выраженными, что позволило выявить агглютиноген В. Это могло зависеть от избытка сыворотки (0,1 мл).

Волосы лиц группы АВ (IV). (5 образцов «выделителей» групповых веществ). Во всех 5 случаях групповая принадлежность волос «выделителей» была определена во всех исследованных навесках при абсорбции сроком в 24 часа.

Результаты обнаружения агглютиногенов изосерологической системы АВО в волосах путем реакции абсорбции агглютининов в количественной модификации суммированы в таблице.

В волосах 14 «выделителей» и 6 «слабых выделителей» групп А(II), В(III) и AB(IV) определяли также сопутствующий агглютиноген 0(H).

При помощи примененной нами козьей иммунной сыворотки анти-О(Н) у 8 «выделителей» агглютиноген 0(H) выявлялся как в крови, так и в слюне, у 2 — только в слюне, у одного — лишь в крови; у 3 лиц этот агглютиноген данной сывороткой вообще не обнаруживался.

Что касается «слабых выделителей», то наличие сопутствующего агглютиногена 0(H) в одном случае было доказано в крови и слюне, в 4 случаях — только в крови; в одном случае этот агглютиноген не выявлялся ни в крови, ни в слюне.

Присутствие сопутствующего агглютиногена 0(H) было доказано в навесках в 25 мг волос 7 «выделителей» (у 6 из них этот агглютиноген был обнаружен в крови и слюне, а у одного лишь в слюне) и одного «слабого выделителя», у которого данный агглютиноген выявлялся не только в крови, но и в слюне.

Отсутствие ослабления или незначительное ослабление титра примененной сыворотки анти-0(Н) при исследования остальных 7 образцов волос «выделителей» и 5 образцов «слабых выделителей» не позволило обнаружить в них данный агглютиноген.

Одновременно с этими опытами производили сравнительное исследование групповых факторов в волосах изосыворотками β и α и иммунными сыворотками анти-В и анти-А в 7 образцах волос группы А (II) (из них один «слабый выделитель»), в 6 образцах группы В(III) (из них один «слабый выделитель») и в 3, образцах «выделителей» группы АВ( IV).

Примечание. Цифры обозначают степень абсорбции в ступенях поглощения (под ступенью поглощения подразумевается одно разведение абсорбированной сыворотки. в котором отсутствует агглютинация. при наличии ее в том же разведении исходной сыворотки; П -- полная абсорбция; о.о. - общее ослабление.

Изосыворотками удалось обнаружить агглютиногены А и В во всех 14 исследованных образцах волос «выделителей». Отрицательный результат был получен в 2 образцах волос «слабых выделителей».

Применение иммунных сывороток дало худшие результаты: агглютиногены А и В были выявлены лишь в 9 образцах волос «выделителей» и в одном образце волос «слабого выделителя».

Поскольку некоторые образцы волос «выделителей» в той или иной мере снижали титр разноименной сыворотки, а волосы «слабых выделителей» почти всегда довольно значительно связывали разноименный агглютинин, была предпринята попытка устранить неспецифические явления применением метода «нагрузки» агглютининами (с титром и объемом сыворотки, равными первоначальным). Однако эта попытка оказалась безуспешной: уничтожалось или резко ослаблялось не только неспецифическое, но и специфическое связывание агллютининов (как изо-, так и иммунных). Лишь в 3 случаях из 32 при «нагрузке» изоагглютининами удалось подтвердить данные первичной абсорбции благодаря уменьшению связывания разноименного агглютинина и не слишком значительному снижению показателей специфической абсорбции.

Следует отметить, что среди исследованных волос 9 образцов были искусственно окрашены растительными (хна) и химическими (урсол, гидропирит, «Гамма», восстановитель) красками и 3 образца обесцвечены перекисью водорода. 10 образцов принадлежали «выделителям» группы 0(I), А(II), В(III) и AB(IV), 2 образца — «слабым выделителям» групп А(II) и В (III). В волосах «выделителей» соответствующие агглютиногены были обнаружены в навесках от 50 до 5 мг, группа одного «слабого выделителя» определена в навесках волос в 50, 10 и 5 мг, а второго — в навеске в 25 мг.

Выводы

1. Предварительная обработка волос 50% раствором бромистого лития в течение часа при температуре 98° повышает проницаемость ороговевшего вещества волос и обеспечивает взаимодействие агглютининов сыворотки с агглютиногенами, содержащимися в волосе.
2. При указанной обработке волос, применении гемагглютинирую- щих сывороток с титром 1 : 16, обычной длительности абсорбции (24 часа) и учете результатов реакции путем развернутого титрования исходных и абсорбированных сывороток на плоскости групповая принадлежность всех исследованных волос «выделителей» была определена с достаточной отчетливостью в навесках не только в 50 и 25, но и в 10 мг. В тех же условиях опыта группа волос «выделителей» определялась и в навесках 5 мг, но иногда требовалось удлинение срока абсорбции до 48 часов.
3. Установлению групповой принадлежности волос «слабых выделителей», как правило, препятствует довольно значительное связывание разноименного агглютинина при низких показателях специфической абсорбции, что подтверждает наблюдения Л.Г. Бирюковой. Следует отметить, что такое явление отсутствует при исследовании волос единичных «слабых выделителей». Причина этого пока остается неясной.
4. В ряде образцов волос групп А(II), В (III) и AB(IV) присутствует сопутствующий агглютиноген 0(H).
5. Употребление при исследовании волос изосывороток |3 и а дает лучшие результаты, чем использование иммунных сывороток анти-В и анти-А.
6. Применение в процессе определения групповой принадлежности волос метода «нагрузки» агглютининами в использованном нами варианте оказалось неэффективным, так как вызывало не только ослабление связывания разноименного агглютинина, но и снижение показателей специфической абсорбции.
7. Искусственное окрашивание волос растительными (хна) и химическими (урсол, гидропирит, «Гамма», восстановитель) красками и обесцвечивание их перекисью водорода не влияет на результаты определения групповой принадлежности их описанным способом.