Цитологический тест прижизненного определения глубины кислородного голодания

Кислородное голодание как типовой патологический процесс сопровождает практически все известные заболевания и многие патологические состояния, встречаемые в судебной медицине. Гипоксия является непосредственной причиной гибели организма в неблагоприятных условиях, она является ведущим звеном в развитии постреанимационной болезни.

Проблеме повреждающего воздействия недостатка кислорода посвящено множество работ, однако до сих пор остаѐтся открытым аспект прижизненного судебно-медицинского контроля глубины и длительности гипоксического воздействия по состоянию пролиферации в тканях, потребляющих и доставляющих кислород.

Материалы и методы исследования.

Для решения этой проблемы исследовано качество пролиферативной активности клеток эпителия разных органов (роговица, язык, пищевод) и клеток системы красной крови при тренировках к умеренной барокамерной гипоксии (подъём на высоту 6000 метров по 4 часа ежедневно в течение недели) и при тренировках к тяжёлой барокамерной гипоксии (ежедневный подъём на высоту 9000 метров по 4 часа в течение недели).

О качестве пролиферативной активности в роговице, языке, пищеводе судили по показателям митотического режима (количество митозов, уровень аномально делящихся клеток, спектр патологических митозов); в системе красной крови – определяли количество зрелых и молодых эритроцитов, а также уровень дегенеративных форм этих клеток.

Тренировки к умеренному и тяжёлому кислородному голоданию моделировали на белых беспородных крысах-самцах массой 170–210 г путем пребывания животных в условиях барометрического разрежения на высотах 6 и 9 тыс. м сроком 4 часа в день (однократно) и в течение недели (многократно). Для получения модели кислородного голодания мы, как и другие исследователи (Е.А. Коваленко, 1973; А.П. Ястребов, 1973; Г.А. Васильев, O.K. Хмельницкий, 1974; Г.Г. Сухих, Б.А. Фролов, Ф.З. Меерсон, 1981; М. Т. Шаов, 1981; Л.Б. Буравкова, Э.С. Маилян, Е.А. Коваленко, 1983), использовали «подъём» животных в барокамере отечественной конструкции (СБК-48) объёмом 1,5 м3.

Животных «поднимали» в среднем со скоростью изменения барометрического давления 13–20 мм pт.cт. Такой умеренный по скорости «подъѐм» мы использовали с учётом данных о зависимости морфофункциональных изменений в различных органах эндокринной системы от быстроты наступления разрежения (Г.А. Васильев, Ю.И. Медведев, O.K. Хмельницкий, 1974) и с учётом допустимых величин скорости изменения барометрического давления (Э.В. Лапаев, Г.И. Тарасенко, В.Н. Чернуха, 1981).

Опыты проводились в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г.). Эвтаназию животных осуществляли быстрой декапитацией на специальной гильотине сразу, через 3, 6 и 24 часа после завершения недельного эксперимента. Забой подопытных и контрольных животных осуществляли в одинаковое время суток (19 часов) с целью исключения циркадных изменений митотической активности (МА). Для характеристики МА эпителия роговицы, языка, пищевода использовали колхицин в дозе 4 мкг/г веса внутрибрюшинно за 2 часа до забоя. Известно, что метафазный блок, создаваемый колхицином, используется не только для характеристики активности митоза, но и косвенно – для оценки активности премитотических процессов. Гистол огическую обработку эпителия роговицы, пищевода, покраску мазков крови производили по общепринятым методикам с применением собственных модификаций по стандартной массовой обработке кусочков органов, тканей (Вдовенко С.В., 1996; 1997).

В опытах было использовано 789 крыс. Результаты оценивали при помощи t критерия Стьюдента.

Результаты исследования

Проведенные исследования ключевых периодов митотического цикла (число ДНК-синтезирующих клеток, интенсивность синтеза ДНК, митотическая активность, соотношение фаз митоза, уровень и спектр патологических митозов) в эпителии разных органов свидетельствовали о дестабилизации размножения клеток, а также о зависимости качества пула пролиферирующих (делящихся) клеток от глубины гипоксического воздействия.

Опыты показали, что под влиянием кислородного голодания митотическая активность (МА) эпителиальных клеток существенно изменялась. Изменения эти, в зависимости от степени и длительности гипоксического воздействия, были либо моно-, либо двухфазными.

Под влиянием тренировки белых крыс к умеренному кислородному голоданию изменения клеточного деления в изучавшихся эпителиальных тканях из двухфазных становились монофазными. Фаза угнетения митотической активности (МА) исчезала. В первые часы после заключительного «подъёма» животных в барокамере у них выявлялась активация клеточного деления. В результате тренировки к умеренному барометрическому разрежению ослаблялся мутагенный эффект кислородного голодания. В первые часы после заключительной тренировки (для языка, пищевода – спустя 3 часа, для роговицы – спустя

6 часов) уровень аномально делящихся клеток и спектр патологии стабилизировались и были таковыми спустя сутки. Делящиеся клетки эпителия роговицы повреждались в несколько большей степени, чем клетки языка, пищевода, однако важно то, что и те и другие повреждения оказались обратимыми.

Под влиянием тяжёлого острого кислородного голодания митотический процесс в эпителии обоих органов нарушался в большей степени. Во-первых, углублялось повреждение клеточных структур митоза, во-вторых, более выраженным становился двухфазный характер МА, и, в-третьих, нарушения распределения клеток по стадиям митоза становились более глубокими и длительными, что свидетельствовало о функциональной нестабильности митотического процесса в клетках. Тренировка к тяжёлому кислородному голоданию не изменяла двухфазный характер МА. После многократного пребывания животных в условиях крайне низкого барометрического разрежения повреждения клеточных структур митоза становились более выраженными и сохранялись в течение длительного периода времени, распределение клеток по фазам митоза существенно нарушалось.

Всё это свидетельствует о выраженной неустойчивости морфофункционального состояния аппарата клеточного деления.

Приведённые данные позволяют нам заключить, что тренировка к умеренной гипоксии способна привести к адаптивным сдвигам, тогда как многократное повторение кислородного голодания тяжёлой степени способствует развитию более выраженных расстройств, т.е. приводит к дисадаптации.

Интересно отметить, что активация клеточного деления отмечалась во всех сериях опытов. Однако она становилась более выраженной и более устойчивой лишь после хронического кислородного голодания тяжёлой степени (спустя сутки после тяжёлого хронического гипоксического воздействия определялось увеличение числа митозов в эпителии роговицы, языка, пищевода). При этом повреждение делящихся клеток и расстройство митотического процесса были наибольшим. Отсюда можно заключить, что чем глубже гипоксическое повреждение делящихся клеток, тем существеннее и длительнее активация митотического процесса.

Более выраженные двухфазные изменения МА и синтеза ДНК отмечались в эпителии роговицы. Уменьшение показателей синтеза ДНК отмечалось в эпителии роговицы как под влиянием острого, так и под влиянием хронического кислородного голодания.

Важно подчеркнуть, что в эпителии роговицы, языка, пищевода сразу после хронического тяжёлого кислородного голодания расстройство синтеза ДНК было менее выраженным, чем после острого тяжёлого кислородного голодания. Митотический режим (МА и распределение клеток по стадиям митоза) при этом, напротив, расстраивался в большей степени. По-видимому, период непосредственной подготовки клеток к митозу (G2-период) и собственно митоз являются наиболее кислородзависимыми периодами митотического цикла. В процессе тренировки к умеренному дефициту кислорода заключительный период митотического цикла (митоз) становится более устойчивым, а под влиянием многократного тяжёлого кислородного голодания повреждения в нём нарастают.

Итак, под влиянием тяжёлых гипоксических воздействий митотический процесс изменяется в большей степени, чем развитие клеток в S-периоде митотического цикла. Умеренные многократные гипоксические воздействия тренируют митотический процесс. Следовательно, в целом реакция клеточного деления на дефицит кислорода определяется, главным образом, изменениями клеточной пролиферации в самом митозе.

Хорошо известно, что дефицит кислорода дестабилизирует пролиферативные процессы в ключевых периодах митотического цикла в клетках красной крови (Гущин В.А., Тавровская Т.В., 1984), активируется их размножение, что увеличивает число эритроцитов как за счет миграции, так и за счёт омоложения системы красной крови полихроматофилами (молодыми эритроцитами). Это связано с действием самой гипоксии, а также влиянием системных и тканевых регуляторов эритропоэза (Е.Д. Гольдберг и др., 2002).

В наших исследованиях увеличение уровня зрелых и молодых эритроцитов (полихроматофилов) было наиболее выраженным под влиянием тренировок к тяжёлой гипоксии. При этом уровень дегенеративных эритроцитов (пойкилоцитоз, анизоцитоз, шизоцитоз), появившись при однократном умеренном гипоксическом воздействии (высота 6 тыс. м), не выявлялся после аналогичного по глубине многократного гипоксического воздействия.

После многократного тяжёлого гипоксического воздействия (9 тыс. м) уровень дегенеративных форм эритроцитов был увеличенным даже спустя сутки после тренировки к этим тяжёлым гипоксическим воздействиям.

Таким образом, умеренные тренировки к дефициту кислорода восполняли пул функционирующих эритроцитов без изменения их качества, тогда как тяжёлые гипоксические воздействия хотя и приводили к более выраженному эритроцитозу, но восполняемый пул эритроцитов был некачественным.

Таким образом, определение качества пула клеток красной крови позволяет судить о степени влияния гипоксии на пролиферативные процессы в периодах митотического цикла не только в самой кроветворной ткани, клетки которой доставляют кислород, но и в других пролиферирующих тканях, потребляющих кислород: чем выраженнее и длительнее сдвиг качества пула размножившихся эритроцитов (стойкое увеличение дегенеративных форм эритроцитов), тем глубже дестабилизация процессов клеточного деления в периодах митотического цикла пролиферирующих тканей (от их угнетения к активации с увеличением аномальных фигур митоза).

В целом, возможность восстановления параметров митотического цикла в эпителии разных органов исключалась под влиянием тяжёлого кислородного голодания в результате повреждения пула функционирующих эритроцитов. По-видимому, повреждённая система красной крови является фактором стойкой гипоксии в пролиферирующих тканях. Последнее обстоятельство является критерием судебно-медицинской экспертизы кислородного голодания как типового патологического процесса.

Список литературы:

1. Вдовенко, С. В. Влияние гипоксии на процессы клеточного деления эпителия роговицы и языка белых крыс / С. В. Вдовенко, С. С. Тимошин // Бюл. эксперимент. биологии и медицины. – 1983. – Т. 96, № 8. – С. 86–87.
2. Пат. 2066447 Российская Федерация. Способ обезвоживания гистологического материала / Вдовенко, С. В.; заявл. 10.09.1996 г. – 6 с.
3. Пат. 2080579 Российская Федерация. Кассета для подготовки образцов биологических тканей к гистологическому исследованию / Вдовенко С.В.; заявл. 27.05.1997 г. – 8 с.
4. Реакции эритроидного ростка кроветворения и механи змы их развития при гипоксии различной степени тяжести / Е. Д. Гольдберг, А. М. Дыгай, Г. Н. Зюзьков и др. // Бюл. эксперимент. биологии и медицины. – 2002. – Т. 134, № 8. – С. 142–145.
5. Гущин, В. А. Влияние длительной адаптации крыс к гипоксии на пролиферацию клеток эритроидного ряда костного мозга. Сообщение I. Увеличение клеточных потоков и уменьшение длительности митоза / В. А. Гущин, Т. В. Тавровская // Цитология. – 1984. – Т. 26, № 2. – С. 215–223.