Биохимические исследования в судебной медицине. Качество результатов

Проблема качества лабораторных исследований была впервые поднята американскими специалистами Belk, Sunderman в 1947 г., когда при сравнении результатов исследований, проведенных в нескольких лабораториях, выяснились существенные различия между ними. С тех пор вопросы обеспечения контроля качества не сходят с повестки дня национальных и международных организаций специалистов лабораторной медицины.

Национальный стандарт Российской Федерации «Государственная система обеспечения единства измерений „Методики (методы) измерений. ГОСТ Р 8.563-2009“» был введен в действие 15 апреля 2010 г. Настоящий стандарт распространяется на методики и методы измерений, включая методики количественного химического анализа (МКХА), и устанавливает общие положения и требования, относящиеся к разработке, аттестации, стандартизации, применению методик измерений и метрологическому надзору за ними.

«Методика (метод) измерений: совокупность конкретно описанных операций, выполнение которых обеспечивает получение результатов измерений с установленными показателями точности». Требования к методикам (методам) измерений в Российской Федерации установлены статьей 5 Фед ерального Закона от 26 июня 2008 г. № 102-ФЗ «Об обеспечении единства измерений» (далее – Федеральный закон «Об обеспечении единства измерений»), в соответствии с которой аттестации подлежат методики (методы) измерений, используемые в сфере государственного регулирования обеспечения единства измерений.

Согласно приказу от 07.02.2000 г. № 45, качество лабораторных исследований должно соответствовать требованиям по аналитической точности.

Внутрилабораторный контроль качества состоит в постоянном (повседневном, в каждой аналитической серии) проведении контрольных мероприятий: исследовании проб контрольных материалов или применении мер контроля с использованием проб пациентов. Целью внутрилабораторного контроля качества является оценка соответствия результатов исследований установленным критериям их приемлемости при максимальной вероятности обнаружения недопустимой погрешности и минимальной вероятности ложного отбрасывания результатов выполненных лабораторией аналитических серий.

Внутрилабораторный контроль качества обязателен в отношении всех видов исследований, выполняемых в любой лаборатории: клинико-диагностической, научно-исследовательской, судебно-химической, судебно-биохимической др. Правила внутрилабораторного контроля качества определяют меры по выявлению и устранению недопустимых случайных и систематических погрешностей количественного анализа биоматериалов и имеют цель – обеспечить соответствие выполняемых исследований установленным нормам точности.

Точность измерений – качество измерений, отражающее близость их результатов к истинному значению измеряемой величины. Высокая точность измерений соответствует малым погрешностям всех видов, как систематических, так и случайных.

Погрешность измерения – отклонение результата измерения от истинного значения измеряемой величины. Систематическая погрешность измерения – составляющая погрешности измерения, остающаяся постоянной или закономерно изменяющаяся при повторных измерениях одной и той же величины. Случайная погрешность измерения – составляющая погрешности измерения, изменяющаяся случайным образом при повторных измерениях одной и той же величины.

Правильность измерений – качество измерений, отражающее близость к нулю систематических погрешностей в их результатах.

Общая воспроизводимость – качество измерений, отражающее близость друг к другу результатов всех измерений, определяется внутрисерийной и межсерийной воспроизводимостью.

Воспроизводимость и правильность являются основными показателями качества результата лабораторного исследования, определяющими общую погрешность (точность) результата измерения – разность между результатом измерения определяемого показателя и истинным значением измеряемой величины.

В зависимости от характера влияния на результаты аналитического исследования различают систематические и случайные погрешности, которые выявляются с помощью многократного исследования контрольного материала в аналитических сериях.

Систематическая погрешность характеризует правильность измерений, которая определяется степенью совпадения среднего результата повторных измерений контрольного материала (Х ср.) и установленного значения измеряемой величины. Разность между ними называется величиной систематической погрешности или смещением, сдвигом и может быть выражена в абсолютных или относительных величинах.

Относительная систематическая погрешность (В) рассчитывается в процентах по формуле:

B = (х-уз)/уз*100 (%) ,

где х – среднее значение измерений контрольного материала, уз – установленное значение контрольного материала.

Случайная систематическая погрешность отражает разброс измерений и проявляется в различии между собой результатов повторных измерений определяемого показателя в одной и той же пробе. Величина случайной погрешности выражается среднеквадратическим отклонением (S) и коэффициентом вариации (СV).

СV = S / Х * 100 (%)

Внутрилабораторный контроль качества лабораторных исследований проводится с использованием контрольных материалов. Контрольным называется однородный материал, результаты исследования которого используются для оценки погрешности выполняемого аналитического измерения. Контрольные материалы промышленного производства с исследованным содержанием используются для контроля правильности и воспроизводимости лабораторного анализа. Для большинства биохимических, токсикологических исследований выпускаются контрольные материалы промышленного производства. Универсальные – содержат большое количество компонентов, концентрация или активность которых исследована по широкому спектру методов. Специальные контрольные сыворотки предназначены для определения контроля качества отдельных компонентов: С-реактивного белка, этанола; компонентов, определяемых при мониторинге лекарств, в том числе методами тонкослойной и высокоразрешающей жидкостной хроматографии. В некоторых специальных контрольных материалах в качестве матрицы используется цельная кровь, например, контрольные материалы для компонентов, исследование которых проводится методами «сухой» химии (определение глюкозы, гемоглобина и гликогемоглобинов, токсических веществ).

Важнейшее значение имеет тип матрицы контрольного материала (предпочтительнее использование материалов с матрицей человеческого происхождения). Специфичность матрицы контрольных материалов касается не только конкретных биологических жидкостей, но и конкретных компонентов и методов их исследования.

Контрольные материалы должны исследоваться так же, как обычные пробы, т.е. в тех же сериях и в тех же условиях.

Осуществление внутрилабораторного контроля качества для каждой из методик состоит из трех последовательных стадий:

1. Оценка внутрисерийной воспроизводимости методики.
2. Оценка систематической погрешности и общей воспроизводимости методики, построение контрольных карт.
3. Проведение оперативного (текущего) контроля качества результатов лабораторных исследований в каждой аналитической серии.

Допускается применение схемы внутрилабораторного контроля качества, рекомендуемого производителем в инструкции к конкретному средству лабораторной диагностики (анализатору, диагностикуму) при условии, что данное средство лабораторной диагностики разрешено Минздравом России.

На первой стадии проводится проверка соответствия внутрисерийной воспроизводимости методики установленным нормам точности. С этой целью проводится 10 измерений определяемого показателя в одном и том же материале в одной и той же аналитической серии. Из полученных 10 результатов рассчитывается коэффициент внутрисерийной вариации методики (CVвс), проверяется, что он не превышает половины предельно допустимого значения коэффициента общей аналитической вариации для 10 измерений, и выполняется неравенство:

CVвс < 0,5 × СV10

Если это неравенство не выполняется, т.е. коэффициент внутрисерийной вариации методики составляет больше половины предельно допустимого значения коэффициента общей аналитической вариации, следует провести работу по снижению коэффициента внутрисерийной вариации данной методики или избрать другую методику.

Если внутрисерийная вариация методики отвечает установленным нормам, переходят к следующей стадии.

Во второй стадии решаются две задачи:

• 1) оценивается соответствие величин систематической погрешности (смещения) и коэффициента общей аналитической вариации методики установленным нормам, т.е. окончательно решается вопрос о возможности еѐ использования для целей лабораторной диагностики;
• 2) для каждого контрольного материала создается контрольная карта (диаграмма) – основной инструмент внутрилабораторного контроля качества количественных исследований.

Для решения первой задачи в 10 аналитических сериях измеряют значение определяемого показателя, выполняя по 1 измерению в каждой серии одновременно в неаттестованных контрольных материалах, выбранных для оперативного (ежесерийного) контроля и в аттестованных контрольных материалах. Указанные 10 серий рекомендуется выполнять по одной в день. По 10 результатам, полученным для каждого из аттестованных материалов, рассчитывают величины относительного смещения (B10).

По результатам, полученным для каждого из неаттестованных материалов, рассчитывают значения коэффициента общей аналитической вариации (CV10).

B10 и CV10 не должны превышать предельно допустимых значений (см. Приложение № 1 к отраслевому стандарту «Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов». Предельные допускаемые значения смещения (в) и коэффициента вариации (CV) определения лабораторных показателей в контрольном материале) (Приказ МЗ РФ от 26.05.2003 г. № 220).

Далее проводят измерения в 10 дополнительных аналитических сериях и для каждого аттестованного материала по 20 результатам, полученным в 20 выполненных сериях, рассчитывают величину относительного смещения (В 20). Для каждого неаттестованного материала по 20 результатам рассчитывают значение общей аналитической вариации (СV20).

Предварительная оценка сходимости, воспроизводимости и правильности измерений лабораторного показателя (1-я и 2-я стадии внутрилабораторного контроля качества) выполняется при внедрении в работу лаборатории каждой новой методики.

В случае внесения существенных изменений в аналитическую систему, а именно – при изменении аналитических принципов измерения (приборов, реактивов, калибровочных средств, контрольных материалов, технологической процедуры и др.), 1-ю и 2-ю стадии внутрилабораторного контроля качества следует повторить.

Из полученных в установочной серии 20 результатов измерений определяемого показателя рассчитывают среднеарифметическое (Х), среднеквадратичное (S) отклонение и контрольные пределы (Х±1S, Х±2S, Х±3S).

Если в ряду результатов оказалось значение, выходящее за пределы Х±3S, его отбрасывают, выполняют еще одну аналитическую серию, после чего снова подсчитывают значения Х и S.

Контрольная карта, построенная по установочной серии измерений, представляет собой график, на оси абсцисс которого откладывается номер аналитической серии (или дата ее выполнения), а на оси ординат – значения определяемого показателя в контрольном материале.

Через середину оси ординат проводят линию, соответствующую среднеарифметическому (Х) значению, и параллельно ей отмечают линии, соответствующие контрольным пределам:

• Х±1S – контрольный предел «1 среднеквадратичное отклонение»;
• Х±2S – контрольный предел «2 среднеквадратичных отклонения»;
• Х±3S – контрольный предел «3 среднеквадратичных отклонения».

Контрольные карты строят для каждого лабораторного показателя и для каждого контрольного материала, предназначенного для оперативного контроля качества.

В каждой аналитической серии проводят однократное (как минимум) измерение показателя в каждом контрольном материале. Количество образцов в аналитической серии не ограничивается. Точки, соответствующие результатам контрольных измерений, наносят на соответствующие контрольные карты.

При отклонении результатов контрольных измерений за контрольные пределы оценивают приемлемость результатов проб пациентов в данной аналитической серии с помощью контрольных правил.

Третья стадия. Проведение оперативного (текущего) контроля качества результатов лабораторных исследований в каждой аналитической серии.

Контрольные правила.

Контрольное правило включает контрольный предел (Х±1S, Х±2S, Х±3S) и количество контрольных измерений в аналитической серии. Контрольные правила обозначаются символами типа Аl, где А – количество контрольных результатов; l – контрольный предел.

• 1-3s – одно из контрольных измерений выходит за пределы Х±3S;
• 2-2s – два последних контрольных измерения превышают предел Х+2S или лежат ниже предела Х-2S;
• R-4s – два контрольных измерения в рассматриваемой аналитической серии расположены по разные стороны от коридора Х±2S;
• 4-1s – четыре последних контрольных измерения превышают Х+1S или лежат ниже предела Х-1S;
• 10х – десять последних контрольных измерений расположены по одну сторону от линии, соответствующей Х.

Порядок оценки контрольных карт.

Проверяют присутствие на контрольных картах предупредительного контрольного правила 1-2s.

Если один из результатов анализа контрольных материалов выходит за пределы Х±2S, последовательно проверяют наличие контрольных правил 1-3s, 2-2s, R-4s, 4-1s и 10х, аналитическая серия признается неудовлетворительной при наличии одного из них.

Если в дополнение к нарушению признака 1-2s обнаруживается хотя бы один из указанных признаков (1-3s, 2-2s, R-4s, 4-1s или 10х), все результаты, полученные в данной аналитической серии, следует считать неприе млемыми.

Проведение анализа приостанавливают, выявляют и устраняют причины возникновения погрешностей. Все пробы, проанализированные в данной серии (и опытные, и контрольные), исследуют повторно.

Результаты измерения контрольных материалов в серии, признанной неприемлемой, не используют при оценке по контрольным правилам повторной и последующих серий.

Если ни один из перечисленных выше признаков не обнаруживается ни на одной контрольной карте, исследования продолжают.

Результаты внутрилабораторного контроля качества должны быть отражены в формах отчетности, которые приведены в приложениях к данному отраслевому стандарту (Приложение № 2 и Приложение № 3 Приказа Минздрава РФ от 26 мая 2003 г. № 220).

Пример выполнения контроля качества для рутинной методики выполнения определения концентрации мочевины в сыворотке трупной крови по цветной реакции с диацетилмонооксимом – набор реагентов «Urea 450» Lachema в судебно-биохимической лаборатории ГБУЗ МО «Бюро СМЭ».

Определение содержания концентрации мочевины в сыворотке крови по цветной реакции с диацетилмонооксимом. Контрольная сыворотка «мультиконт» нормальный уровень Хср 6,7 ммоль/л 1S = ±0,5 ммоль/л Lot 1164234-01 до 04,14 ммоль/л.

Приводим пример проведения ежедневного контроля качества судебнобиохимических исследований проводимого перед исследованием образцов сыворотки трупной крови на биохимическом анализаторе.

Ежедневный контроль качества судебно-биохимических исследований

Полученные по результатам измерений определяемого компонента в контрольном материале расчетные величины В20 и CV20 не превышают предельно допустимые значения смещения и коэффициента общей аналитической вариации Таблицы 1 Приложения 3 Приказа МЗ РФ № 45 от 07.02.2000 г.

Как видно из вышеприведенной сводной таблицы, перед началом выполнения биохимических исследований проводят анализ контрольных сывороток с аттестованным содержанием интересуемых по каждому биохимическому параметру компонентов: Abtrol – патологический уровень и Nortrol – нормальный уровень. Если полученный результат определения укладывается в допустимые пределы колебаний (Х±2S) для данного компонента согласно приведенным паспортным данным контрольной сыворотки, то такой результат считается правильным.

Контрольная карта строится и по каждому исследуемому биохимическому параметру в отдельности, по которой можно проследить все предупредительные и контрольные критерии оценки контрольных карт.

Как видно в колонке Z в таблице с результатами ежедневного контроля качества выполняемых биохимических исследований ни одно из контрольных измерений не выходит за пределы даже Х±2S, не говоря уже о пределах Х±3S. То есть контрольные правила не нарушены. О чем в колонке «нарушения» анализатор не выводит замечаний по несоблюдению контрольных правил. Соблюдения правил контроля качества хорошо видны на контрольной карте (рис. 1), построенной анализатором после исследования контрольных сывороток.

РЕЗУЛЬТАТЫ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА

Рис. 1. Контрольная карта (объяснение в тексте)

Результаты судебно-биохимических исследований сыворотки трупной крови должны максимально соответствовать прижизненным показателям крови, иначе не будет возможности сопоставить прижизненные и посмертные показатели. Для этого необходимо соблюдать все правила преаналитики. Проводить забор материала в первые 24 часа после смерти в специальные пробирки, в зависимости от того, какой аналит исследуется. Сразу после забора материала его центрифугируют, соблюдая g-центрифугирования, время, температурный режим. Если после центрифугирования сыворотка была отделена от форменных элементов крови c помощью специального геля, то пробирку можно хранить в холодильнике до отправки в лабораторию на исследование. В других случаях сыворотку необходимо сразу отобрать в отдельную пробирку, чтобы исключить контакт с эритроцитами. Для каждого исследуемого биохимического аналита существуют свои особые требования, которые необходимо по возможности соблюдать и при исследовании трупной крови. Иначе мы будем получать результаты биохимических исследований, очень далекие от прижизненных, которые не смогут оказать помощь эксперту-танатологу в установлении причины смерти, а наоборот, будут вводить его в заблуждение. Цель судебнобиохимических исследований – получить результаты анализов, соответствующие прижизненным показателям на момент смерти с минимальной погрешностью, а не проводить исследование аналитов, которые получились в пробирке in vitro.

Список литературы:

1. Клиническая лабораторная аналитика в пяти томах. Т. 1: Основы клинического лабораторного анализа / под общ. ред. В.В. Меньшикова. – М.: АгатМед, 2002.
2. Меньшиков, В. В. Стандартизация в клинической лабораторной медицине. Организационные и метрологические аспекты. – М.: Лабора, 2005.
3. О системе мер по повышению качества клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения Российской Федерации: приказ Минздрава РФ от 07.02.2000 № 45.
4. Федеральный закон от 26 июня 2008 г. № 102-ФЗ «Об обеспечении единства измерений».
5. ГОСТ Р 8.563-2009 ГСИ. Методики (методы) измерений.– М.: Госстандарт, 2009.
6. Об утверждении порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно -экспертных учреждениях Российской Федерации: приказ Минсоцразвития России № 346н от 12.05.2010 г.
7. Долгов, В. В. Национальное руководство. Клиническая лабораторная диагностика: нац. рук. Т. 1 / В. В. Долгов, В. В. Меньшиков. – М.: ГЭОТАРМедиа, 2012. – 928 с.
8. О введении в действие рекомендаций по межгосударственной стандартизации: постановление Гос. комитета РФ по стандартизации и метрологии № 47-ст от 30.01.2004 г.
9. Об утверждении отраслевого стандарта «Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов»: приказ Минздрава РФ № 220 от 26 мая 2003 г.