Исследование биологического материала на пилокарпин

В литературе мало уделяется внимания исследованию на пилокарпин в судебно-химическом анализе. Задачей настоящей работы является изучение возможности идентификации пилокарпина в трупном материале кристаллооптическим методом.

Обнаружение веществ этим методом основано на определении их оптических констант: осности, угла погасания, знака удлинения, показателей преломления, двупреломления и др. Различие этих констант позволяет с большой точностью идентифицировать вещества. По специфичности и чувствительности кристаллооптический метод значительно превосходит микрокристаллоскопический метод анализа (О.А. Аншелос, Т. Н. Буракова).

Кристаллооптический анализ возможен лишь при наличии кристаллического вещества.

Пилокарпин легко образует осадки в виде игольчатых или призматических кристаллов и сростков с растворами пикриновой, пикролоновой, стифниновой кислот, с хлорным золотом, хлорным золотом и бромистым калием и с солью Рейнеке (тетрароданодиаминохромиатом аммония). Идентификация пилокарпина по форме кристаллов не всегда возможна, так как некоторые другие алкалоиды образуют с указанными реактивами близкие по форме кристаллы.

В предыдущих работах (В. Т. Позднякова) определены кристаллооптические константы стифната, пикрата, пикролоната, рейнеката и бромаурата пилокарпина. Они резко отличаются от констант аналогичных соединений других алкалоидов и могут быть использованы для идентификации пилокарпина.

Наши предварительные исследования показали, что реакции пилокарпина с пикриновой и пикролоновой кислотами мало чувствительны и потому менее пригодны, чем остальные описанные выше реакции.

В основу идентификации пилокарпина в биологическом материале легли реакции с 5% раствором хлорного золота и крупинкой бромистого калия, 5% раствором хлорного золота, 1% свежеприготовленным раствором соли Рейнеке (тетрароданодиаминохромиата аммония) и 0,5% раствором стифинновой кислоты. Реакции выполняли на предметных стеклах путем соединения капли исследуемого раствора с реактивом. Кристаллооптические константы, за исключением хлораурата пилокарпина, описаны нами ранее.

Чувствительность реакции пилокарпина с 5% раствором хлорного золота и кристаллооптические константы хлораурата пилокарпина приводим ниже.

Хлораурат пилокарпина C 11 H16 N 2 O2 • AuCl 3 игольчатые кристаллы (средний размер 0,8X0,02 мм), двуосные, ромбической сингонии, угол погасания прямой, знак удлинения положительный. Показатели преломления: n р = 1,558, nm = 1,576, n g = 1,662; двупреломление: n g —nр = 0,104. Открываемый минимум: 0,74 γ пилокарпина. Предельная концентрация 1 : 13 500.

Основные задачи настоящей работы: установление возможности применения микрокристаллоскопии и кристаллооптики для идентификации пилокарпина в биологическом материале; определение границ обнаружения пилокарпина при изолировании его из указанного объекта как подкисленным спиртом, так и водой, подкисленной серной кислотой. Общая схема хода работы по изолированию и идентификации пилокарпина такова:

1. Подготовка объекта к исследованию (измельчение 100 г печени трупа, добавление навески пилокарпина, перемешивание и настаивание объекта в течение 24 часов).
2. Изолирование пилокарпина подкисленным спиртом либо подкисленной водой.
3. Растворение выделенного остатка в 1 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты и проведение микрокристаллоскопических реакций.
4. Удаление маточного раствора полосками фильтровальной бумаги, промывание осадка каплей воды, высушивание и определение кристаллооптических констант продуктов реакций на столике Е.С. Федорова, прикрепленном к столику поляризационного микроскопа. Показатели преломления измеряли иммерсионным методом при помощи набора иммерсионных жидкостей Львовского завода заказных реактивов.

Границы обнаружения пилокарпина каждый раз определяли одной реакцией в извлечении из 100 г органов.

Изолирование пилокарпина подкисленным спиртом и результаты идентификации. Пилокарпин изолировали по методике, описанной М.Д. Швайковой. извлекали хлороформом в количестве 15—20 мл на одно выбалтывание (выбалтывали 3—4 раза). Идентификацию проводили в остатках, извлеченных из щелочного раствора. Очистку выделенных остатков не производили. При проведении микрокристаллоскопических реакций форма кристаллов и кристаллооптические константы оставались такими же, как и при аналогичных реакциях с чистыми растворами пилокарпина.

В результате наших исследований выявлены следующие границы обнаружения пилокарпина в биологическом материале: с хлорным золотом и бромистым калием — 3 мг, с хлорным золотом — 4 мг, с солью Рейнеке — 7 мг, со стифниновой кислотой — 20 мг на 100 г материала.

Помимо опытов с искусственными средами, мы произвели затравку собаки пилокарпином и дальнейшее исследование отдельных ее органов на присутствие пилокарпина.

Щенку весом 1230 г введено per os 0,2 г яда. Для анализа взято 11 г желудка, 34 г печени с желчным пузырем, 34 г кишечника, 35 г почки с мочой. Пилокарпин изолировали подкисленным спиртом из щелочного раствора (из каждого органа в отдельности). Очистку остатков не производили. К выделенным остаткам добавляли 1—2 мл 0,1 н. соляной кислоты и проводили микрокристаллоскопические реакции. Образовавшиеся кристаллы подвергали кристаллооптическому анализу.

Наилучшим образом пилокарпин идентифицировался в остатках, извлеченных из почек: со всеми названными реактивами мы получили резко положительные (образование бромаурата и хлораурата) и положительные (образование стифната и рейнеката) реакции. Хорошо идентифицировался пилокарпин в желудке с содержимым и несколько хуже в печени и кишечнике.

Рис. 1. Кристаллы бромоаурата пилокарпина, выделенные из чистого раствора алкалоида.

Изолирование пилокарпина водой, подкисленной серной кислотой, 100 г измельченного материала, содержащего пилокарпин, заливали слабым раствором серной кислоты (до покрытия его жидкостью), несколько раз хорошо перемешивали стеклянной палочкой, добавляли серную кислоту до pH 2,5, оставляли на 2 часа и процеживали через марлю. Твердые остатки материала, оставшиеся на марле, еще 3 раза настаивали по 1—2 часа с водой, подкисленной серной кислотой до pH 2,5. Процеженные через марлю жидкости, полученные при каждом настаивании с подкисленной водой, соединяли и центрифугировали, осторожно сливали с осадка, а остаток в течение часа еще раз обрабатывали водным раствором серной кислоты до pH 2,5 и центрифугировали. К объединенным вытяжкам после центрифугирования прибавляли сульфат аммония до насыщения. Если при этом pH вытяжки изменялся, его доводили до 2,5. Остаток примесей, образовавшийся от прибавления сульфата аммония к кислой вытяжке, через час отделяли центрифугированием. Кислую вытяжку 1—2 раза взбалтывали с. 50 мл эфира. Эфирный слой отделяли, а к водной вытяжке добавляли раствор едкого натра до pH 8,5—9,0. Из подщелоченной вытяжки пилокарпин 3 раза экстрагировали хлороформом, при этом каждый раз объем хлороформа в 3 раза был меньше объема водной фазы. Хлороформные извлечения соединяли вместе, после чего хлороформ отгоняли на водяной бане. Сухие остатки, как указано в общей схеме проведения работ, растворяли в 1 мл 0,1 н. соляной кислоты и проводили микрокристаллоскопические реакции с последующим кристаллооптическим анализом.

В результате выявлены следующие границы обнаружения пилокарпина: с хлорным золотом и бромистым калием— 1 мг, с хлорным золотом — 2 мг, с солью Рейнеке — 7 мг, со стифниновой кислотой — 7 мг на 100 г биологического материала.

Таким образом, границы обнаружения пилокарпина перечисленными реакциями при извлечении его из биологического материала водой, подкисленной серной кислотой, несколько выше границ обнаружения данного алкалоида, извлеченного подкисленным спиртом.

Однако следует отметить, что в отдельных опытах при идентификации пилокарпина, извлеченного из биологического материала водой, подкисленной серной кислотой, наблюдалось изменение формы кристаллов. Так, в реакциях пилокарпина с 5% раствором хлорного золота и крупинкой бромистого калия при концентрациях пилокарпина 0,02 г на 100 г объекта и менее наблюдается дендритообразное изменение формы кристаллов бромаурата. На рис. 1 показаны кристаллы бромаурата пилокарпина в виде игл, выделенные из чистого раствора; на рис. 2 — кристаллы бромаурата пилокарпина, выделенные из трупного материала в концентрации 0,01 г на 100 г трупного материала. Кристаллооптические константы оставались неизмененными.

Рис. 2. Кристаллы бромаурата пилокарпина, выделенные из трупного материала.

Выводы

1. Идентификация пилокарпина в биологическом материале микро- рристаллоскопическими реакциями, проводимыми на основе кристаллооптики, возможна. Кристаллооптический анализ продуктов реакций позволяет с уверенностью говорить о нахождении пилокарпина. Наиболее пригодны для этого реакции образования бромаурата, хлораурата, рейнеката и стифната пилокарпина.

2. Пилокарпин легко изолируется из биологического материала как подкисленным спиртом, так и водой, подкисленной серной кислотой.