Использование метода ферментативного гидролиза для изолирования производных барбитуровой кислоты из крови (на примере фенобарбитала и барбамила)

Асп. Н.А. ЧУВИНА¹, врач А.С. КОЛУПАЕВА¹, доц. О.Ю. СТРЕЛОВА¹, врач-эксп. И.В. ЗАБЛОЦКАЯ², врач-эксп. Т.В. ГОРБАЧЕВА²

¹Кафедра фармацевтической химии (зав. — проф. Р.Е. Трифонов), ²ГУЗ Санкт-Петербурга «БСМЭ», (нач. — проф. Г.П. Лаврентюк)

Методы изолирования прямой экстракцией органическими растворителями или после осаждения белков различными осадительными или высаливающими агентами малоэффективны и не позволяют выделить производные барбитуровой кислоты из их комплекса с белками крови. Применение ферментативного гидролиза позволяет разрушить связь барбитуратов с белками и повысить эффективность изолирования. Проводили гидролиз с использованием ферментов трипсин, пепсин, химотрипсин и папаин модельных комплексов фенобарбитал—кровь и барбамил—кровь. Степень экстракции фенобарбитала составила при использовании трипсина 62,1±1,2%, барбамила — 75,1±1,6%. Увеличение степени экстракции по сравнению с таковой при использовании традиционных методов составило для фенобарбитала 32,7±1,0%, для барбамила 51,1±1,0%. Для предлагаемой методики определены некоторые валидационные характеристики.

Ключевые слова: производные барбитуровой кислоты, фенобарбитал, барбамил, ферментативный гидролиз, трипсин, пепсин, химотрипсин, папаин, кровь, количественное определение, высокоэффективная жидкостная хроматография, валидация.

The use of enzymatic hydrolysis for isolation of barbituric acid derivatives from blood (as exemplified by phenobarbital and barbamyl)

N.A. CHUVINA, A.S. KOLUPAEVA, O.YU. STRELOVA, I.V. ZABLOTSKAYA, T.V. GORBACHEVA  

Modern isolation techniques by direct extraction with organic solvents or after protein precipitation by various sedimenting or salting-out agents are characterized by low efficiency and do not permit to liberate derivatives of barbituric acid from their complexes with blood proteins. The use of enzymatic hydrolysis makes it possible to break bonds between barbiturates and protein and thereby improve the efficiency of isolation. We performed enzymatic hydrolysis of the model phenobarbital-blood and barbamyl-blood complexes with the use of trypsin, pepsin, chymotrypsin, and papain. The degree of phenobarbital extraction with trypsin and barbamyl was estimated at 62,1±1,2% and 75,1±1,6% respectively; in other words, it was 32,7±1,0% and 51,1±1,0% higher than that achieved by traditional methods. Certain validation characteristics of the new method are presented.

Key words: derivatives of barbituric acid, phenobarbital, barbamyl, enzymatic hydrolysis, trypsin, pepsin, chymotrypsin, papain, blood, quantitative determination, high performance liquid chromatography, validation.