Применение биофизических методик для установления сроков наступления смерти

В последнее время широко изучают химические, гистохимические, биохимические, физические и другие изменения тканей и органов после наступления смерти. Имеются данные, что самыми уязвимыми элементами клеток являются их фосфолипидные мембраны и субклеточные органеллы. При нарушении обмена веществ происходят сложнейшие биохимические изменения в организме, в том числе нарушаются ферментативные процессы в субклеточных структурах. Хаотическая деятельность ферментных систем, прежде всего систем, регулирующих окислительно-восстановительные реакции в митохондриях, создает предпосылки к образованию новых условий в организме: понижается концентрация О₂, исчезает АТФ, изменяется рН и т.д. При этом нарушается распределение ионов в клетке, разрушаются мембранные структуры, наступает гибель клеток, тканей и организма как целого.

Таблица 1

Скорость потребления кислорода и коэффициент усиления митохондрий

Для изучения этих процессов мы предприняли исследование с применением биофизических методик. Объектом исследования служила печень белых крыс.

У забитых крыс (черепно-мозговая травма) через различные периоды (от 0 до 6 ч после смерти) брали кусочек печени весом 1 г. Все операции производили в кристаллизаторе со льдом. Выделяли митохондрии методом дифференциального центрифугирования: 0,25М сахарозы +2,5 мМ трис-буфера, рН 7,4. Суспензию митохондрий разводили средой выделения так, чтобы из 1 г печени получился 1 мл суспензии. Использовали инкубационную среду: 10 мМ КСl + 20мМ К2НРО4 при рН 7,5. Скорость потребления кислорода суспензией измеряли полярографически. В кювету вносили 4 мл инкубационной среды, 0,5 мл суспензии, 40 мкмолей янтарной кислоты, 1 мкмоль АДФ и 0,16 мкмоля ДНФ.

Добавка субстрата (сукцинат или глутамат) к свежевыделенным митохондриям приводила к интенсивному дыханию, а добавка АДФ усиливала потребление кислорода. В последующих пробах в первую очередь понижался коэффициент усиления митохондрий. В табл. 1 приведена полярографическая запись потребления кислорода в суспензии митохондрий, выделенных через определенное время после смерти.

Как видно из табл. 1, уже через 30 мин после смерти дыхание митохондрий тормозится как в присутствии субстратов (состояние 4 по Чан-су), так и в присутствии АДФ (состояние 3), снижается дыхательный контроль.

Посмертные изменения мембранных структур, в частности митохондрий, могут возникать от разных причин, в частности от действия гидролитических ферментов лизосом. Увеличение проницаемости лизосомальных мембран и выход лизосомальных катепсинов, фосфолипазы и др. в клетку должны приводить к ее автолизу. Можно предположить, что лизосомальная фосфолипаза, действуя на фосфолипидную часть мембраны митохондрий, расщепляет ее, высвобождая ненасыщенные жирные кислоты, которые разобщают окисление и фосфорилирование.

Гибель клетки может быть также связана с проникновением ионов кальция в клетку, лишенную источников энергии. Активный транспорт кальция в митохондрии может приводить к их набуханию и повреждению (снижение дыхания), с другой стороны, наличие кальция в клетке будет активизировать митохондриальную фосфолипазу, что также приводит к разобщению окислительного фосфорилирования (потеря дыхательного контроля). Одновременно эти повреждения митохондрий должны привести к изменению содержания белка и свойств фосфолипидов.

Количество белка в митохондриях определяли через 3 и 6 ч после смерти по микробиуретовой методике. Одномоментно определяли интенсивность белковой флуоресценции. Содержание белка по обоим показателям уменьшалось в первые 6 ч после смерти. Интенсивность люминесценции митохондрий (из одного количества тканей) через 0, 3, 6 ч составляла 100%, 68,5% и 54,3% при содержании белка 1, 0,5, 0,25 мг/мл соответственно (см. табл. 2).

Таблица 2

Изменение концентрации белка в суспензии митохондрий, белковой флюоресценции и интенсивности хемилюминесценции

Примечание. В пробах содержались митохондрии, выделенные из 10 мг ткани.

Интересно также было также выяснить изменения в фосфолипидах, критерием которых может быть изменение скорости процесса перекисного окисления остатков жирных кислот. Физическим методом, позволяющим регистрировать перекисное окисление липидов митохондрий, является измерение сверхслабого свечения (биохемилюнесценция). Исходя из этого, мы исследовали изменения интенсивности и характер хемилюминесценции суспензии митохондрий, выделенных через различное время после смерти. Для этого использовали установку, состоящую из фотоумножителя ФЗУ-42, усилителя постоянного тока и самописца. Суспензию помещали в термостатическую кювету, реакционную смесь насыщали кислородом с помощью стеклянной мешалки. Измеряли хемилюминесценцию в присутствии ионов двухвалентного железа, являющегося катализатором процесса переокисления липидов. Через определенное время после смерти интенсивность хемилюминесценции уменьшалась (см. табл. 2) и изменялся характер кривой развития свечения.

Таким образом, биофизические методы позволяют обнаружить изменения мембранных структур на ранних этапах после смерти. Процессы, разобщающие окислительное фосфорилирование и приводящие к повреждению мембран митохондрий, можно регистрировать полярографическим методом уже через 20—30 мин после смерти. Позже развиваются изменения липидов, проявляющиеся в виде изменения интенсивности и кинетики хемилюминесценции. Одновременно наблюдаются изменения белка суспензий и соответственно уменьшение интенсивности белковой люминесценции.

Биофизические методы позволяют объективно регистрировать нарушения в мембранах митохондрий и тем самым устанавливать и изучать интимные процессы, приводящие к гибели клеток и тканей, а также определять давность наступления смерти в пределах первых 6 ч.