Возможность обнаружения семенных пятен без нахождения в них сперматозоидов (сообщение I)

В последние годы интерес исследователей привлекла молекулярная гетерогенность биологически активных веществ и в первую очередь ферментов в различных тканях и органах. Речь идет о тканевой и органной специфичности ферментов. Учитывая, что сперма имеет исключительно сложный белковый состав и является одной из самых активных в биологическом плане жидкостей организма, мы исследовали молекулярную гетерогенность некоторых ее ферментов в аспекте их специфичности для данного экскрета.

Исследования Boyer (1963), Beckman и Regan (1964), Lundin и Allison (1965), Beckman, Björling и Christodoulou (1966), а также собственные наблюдения свидетельствуют о высокой органной и тканевой специфичности указанных выше ферментов. Markert и Мöller (1959) выявили 5 изоферментов лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в различных тканях, онтогенетические и органоспецифические различия в электрофоретически разделенных компонентах фермента. Было также отмечено различное отношение 5 изоферментов ЛДГ-1—ЛДГ-5 (по уменьшающейся подвижности к аноду) в некоторых органах и тканях человека. Blanco и Zinkham (1963) наблюдали дополнительный компонент ЛДГ-активности на фореграммах гомогенатов яичек. Davidson и соавт. (1965) также наблюдали в электрофоретически разделенных образцах спермы дополнительный компонент ЛДГ, названный ими «Х»-компонентом.

Мы изучали изоферменты ЛДГ в сперматозоидах и семенной плазме, сравнивая их с изоферментами ЛДГ крови и некоторых других выделений. Исследовали также возможность выявления изоферментов ЛДГ в экспериментальных пятнах крови и спермы.

Изоферменты ЛДГ заинтересовали нас еще и потому, что до сих пор этот фермент совершенно не изучен в судебно-медицинском аспекте. Это связано, по-видимому, с тем, что в данной ферментной системе отсутствует генетически обусловленный полиморфизм. Атипичные варианты ЛДГ в эритроцитах человека встречаются редко.

Материал и метод. Исследовали сперму из семенных пузырьков трупов и сперму живых мужчин (20 образцов), трупную кровь и кровь живых лиц (20 образцов), а также слюну и пот от 10 лиц. Электрофоретически исследовали спермолизаты, семенную плазму без сперматозоидов, сыворотку крови и гемолизаты эритроцитов, слюну, а также вытяжки из экспериментальных пятен крови, спермы, слюны, пота и вытяжки из смешанных пятен крови и спермы. Спермолизаты готовили следующим образом: цельную сперму ценрифугировали при 5000 об/мин 25—30 мин, надосадочную жидкость (семенную плазму) отделяли и осадок сперматозоидов 5 раз отмывали физиологическим раствором. Спермолизаты готовили из отмытых сперматозоидов путем добавления к ним дистиллированной воды в отношении 1:1 с последующим замораживанием, оттаиванием и центрифугированием. Экспериментальные пятна крови и выделений приготовляли на марле и исследовали на 1—10-й день. Проводили горизонтальный электрофорез в крахмальном геле 16—18 ч при градиенте напряжения 5 В/см в условиях холодильника. Использовали трис-ЭДТА — Н3ВО3 буферную систему по Nance и сотр. (1963). Для выявления ЛДГ-активности использовали инкубационную смесь следующего состава: 100 мл 0,2 М фосфатного буфера, рН 7,4, 10 мл 1 М раствора лактата натрия, 10 мл 0,1 М раствора хлористого натрия, 10 мл 0,3 М раствора хлористого магния, 20 мг НАД (никотинамидадениндинуклеотид), 20 мг НСТ (нитросиний тетразолевый), 1 мг ФМС (феназинметосульфат). Инкубацию крахмального геля проводили в термостате при 37° в течение 1 ч, после чего учитывали результаты.

Фореграмма лактатдегидрогеназы крови и
выделений.
Сверху вниз: спермолизат, гемолизат,
гемолизат, семенная плазма, сыворотка
крови, вытяжка из пятна пота,
сыворотка крови» слюна.

Важное значение имеет подбор оптимальных условий электрофореза и выявление ферментативной активности. Для четкого разделения необходимо использовать плотный (15%) крахмальный гель, проводить электрофорез при низкой (20—25 мА) силе тока в течение 16—18 ч в условиях холодильника. Стартовые щели не должны располагаться ближе 10 см от катодного края геля. Используя для выявления ЛДГ-активности метод Markert и Мöller (1959), мы значительно увеличили по сравнению с оригиналом содержание в растворе хлористого магния, являющегося активатором ЛДГ, в инкубационной среде с 0,005 М до 0,3 М. Вместо рекомендованного тетразолевого красителя (МТТ) использовали НСТ, который не придавал неблагоприятного синего фона фореграммам ЛДГ.

Результаты исследования. Полученные изоферменты ЛДГ представляют собой ряд параллельных сиренево-фиолетовых полос различной интенсивности, возникающих в результате реакции с образованием нерастворимых солей формазана. Компоненты ЛДГ-1—ЛДГ-4 имеют анодную подвижность, а ЛДГ-5 мигрирует к катоду.

Наибольшей ферментативной активностью обладали гемолизаты эритроцитов, сыворотка крови и семенная плазма без сперматозоидов (отсутствие сперматозоидов подтверждалось микроскопически). Изоферментный спектр ЛДГ эритроцитов, сыворотки крови и семенной плазмы имел высокую активность, но был различным (см. рисунок на вклейке).

Гемолизаты эритроцитов демонстрировали 3 четких компонента: ЛДГ-1, ЛДГ-2 и ЛДГ-3, которые имели почти одинаково высокую активность. Компоненты ЛДГ-4 и ЛДГ-5 в эритроцитах отсутствовали.

Сыворотка крови демонстрировала 5 компонентов ЛДГ, причем наиболее интенсивны были ЛДГ-1, ЛДГ-2 и ЛДГ-3. В некоторых образцах катодный компонент ЛДГ-5 имел высокую ферментативную активность и не уступал по интенсивности окрашивания ЛДГ-1 — ЛДГ-3.

Изоферментный спектр ЛДГ семенной плазмы имел характерные особенности. Помимо 5 обычных компонентов (компоненты ЛДГ-1 и ЛДГ-5 имели низкую интенсивность окрашивания), он демонстрировал дополнительный компонент ЛДГ («Х»-компонент, по Davidson и соавт., 1965), который мигрировал между ЛДГ-3 и ЛДГ-4.

Изоферментный спектр ЛДГ спермолизатов, также как и гемолизатов эритроцитов, характеризовался только 3 компонентами — ЛДГ-1, ЛДГ-2 и ЛДГ-3, однако активность их (особенно ЛДГ-1) была гораздо ниже. На фореграммах видно, что дополнительный «Х»-компонент фермента присущ не сперматозоидам, а семенной плазме. Наши исследования показали отсутствие существенной разницы в спектрах ЛДГ крови и спермы, взятых у живых лиц и у трупов. В некоторых случаях можно было отметить чуть меньшую активность ЛДГ в трупном материале.

В слюне выявлялись два слабоинтенсивных компонента — ЛДГ-2 и ЛДГ-3, и в ряде образцов — ЛДГ-5 с крайне низкой активностью. В образцах слюны, длительное время хранившихся в холодильнике, компонент ЛДГ-5 был выражен сильнее.

Из пятен спермы, крови, слюны, пота и смешанных пятен крови и спермы готовили вытяжки, которые также подвергли электрофоретическому исследованию (измельченный кусочек пятна размером 1 см² заливали без избытка физиологическим раствором и экстрагировали в холодильнике 20—24 ч).

В пятнах крови четко выявлялись все 5 компонентов, причем быстро мигрирующие ЛДГ-1, ЛДГ-2 и ЛДГ-3, присущие как эритроцитам, так и сыворотке крови, были выражены несколько сильнее, чем ЛДГ-4 и ЛДГ-5.

В пятнах спермы выявлялись 6 компонентов — слабовыраженные ЛДГ-1 и ЛДГ-5 и значительно более интенсивные ЛДГ-2, ЛДГ-3, ЛДГ-4 и характерный для семенной плазмы «X».

В смешанных пятнах крови и спермы также отчетливо выявлялись 6 компонентов. Компоненты ЛДГ-1, ЛДГ-2 и ЛДГ-3 окрашивались очень интенсивно, ЛДГ-4, ЛДГ-5 и «X» семенной плазмы — несколько слабее.

Только в очень свежих пятнах слюны мы смогли выявить 2 компонента — ЛДГ-2 и ЛДГ-3 с очень низкой активностью. Уже на 4—5-й день в пятнах слюны изоферменты ЛДГ не выявлялись.

Изоферментный спектр ЛДГ в свежих пятнах пота был еще более скудным — только в половине исследованных образцов можно было обнаружить единственный компонент ЛДГ-активности, крайне слабо окрашенный, мигрирующий со скоростью ЛДГ-2. Во всех исследованных пятнах пота давностью свыше 5 дней ЛДГ-активность отсутствовала.

Сравнение активности изоферментов ЛДГ крови и спермы в пятнах давностью 1—2 дня и 10 дней показало полную тождественность. По-видимому, активность фермента в крови и сперме настолько велика, что на фореграммах трудно визуально уловить изменение интенсивности компонентов ЛДГ за небольшой срок. Эти данные обнадеживают. По-видимому, можно будет легко выявлять спектр ЛДГ и при значительно большей давности. Окончательному решению этого вопроса будут способствовать исследования активности изоферментов ЛДГ в более старых пятнах крови и спермы.

Выявление в пятнах спермы особого компонента ЛДГ, присущего только семенной плазме, открывает принципиально новую возможность установления семенного происхождения пятен: без обнаружения в них сперматозоидов. Ценность метода состоит в том, что он основывается на характерных особенностях изоферментов ЛДГ семенной плазмы, постоянно присутствующих в пятнах спермы, в то время как сперматозоиды могут быть разрушены или полностью отсутствовать. Метод, по-видимому, найдет применение при исследовании загрязненных пятен спермы, при азооспермии и олигоспермиях, а также при исследовании смешанных пятен спермы и крови, в которых нахождение сперматозоидов бывает весьма затруднительным. Он позволит впервые практически использовать органо- и тканеспецифичность ферментов для решения важного вопроса судебно-медицинского исследования вещественных доказательств — установления пятен спермы без выявления сперматозоидов.

Дальнейшие исследования в этой области, очевидно, должны быть направлены в первую очередь на изучение возможности выявления особенностей изоферментного спектра ЛДГ в старых пятнах спермы и в патологически измененном эякуляте, в органах, тканях и секретах с тем, чтобы окончательно решить вопрос о строгой специфичности так называемого «Х»-компонента ЛДГ для семенной плазмы.