Применение сефадекса G-25 для очистки гексобарбитала и этаминал-натрия, выделенных из биологического материала

В последнее время для разделения веществ, имеющих в основном значение в медицине и биологии (белки, гормоны, ферменты и т. д.), применяется метод гель-хроматографии (Г. Детерман, 1970).

Впервые для целей судебно-химического анализа метод гель-хроматографии использовали В.П. Крамаренко и соавт. (1971) и В.И. Попова (1972). Принцип применения гель-хроматографии в токсикологическом анализе основан на различии молекулярных весов исследуемых веществ и примесей. Примеси, содержащиеся в вытяжках из биологического материала, как правило, имеют больший молекулярный вес, чем исследуемые токсикологически важные вещества, и поэтому элюируются раньше их.

Для отделения гексобарбитала и этаминал-натрия от примесей белковых и других, веществ мы применили гель сефадекса G-25 (размер частиц в сухом состоянии от 100 до 300 мкм). Этот гель мы получали путем настаивания сефадекса G-25 с 0,02 н. раствором серной кислоты в течение 3 ч. Набухший гель помещали в стеклянную колонку (внутренний диаметр 2,5 см, высота — 40 см). Через набухший гель пропускали по 10 мл водных раствором барбитуратов. Эти опыты показали, что после внесения водных раствором гексобарбитала или этаминал-натрия в колонку и элюирования их 0,02 н. раствором серной кислоты гексобарбитал собирается в 13—28 фракциях элюата, а этаминал — в 13—32 фракциях (объем каждой фракции 10 мл). Причем в последних 2—3 фракциях содержалось только незначительное количество барбитуратов.

Наличие этих веществ в элюатах определяли методом спектрофотометрии в УФ-области спектра (спектрофотометр СФ-4А, кювета 1 см).

После изучения распределения чистых препаратов в элюатах мы изучили распределение белковых веществ и продуктов их распада на колонке, заполненной гелем сефадекса G-25. Для этого 100 г «свежей» измельченной печени трупа, не содержащей барбитуратов, заливали 200 мл 0,02 н. раствора серной кислоты и смесь доводили до рН 2,0—3,0 добавлением 10% раствора серной кислоты (по универсальному индикатору). Смеси настаивали в течение 2 ч. Полученные вытяжки сливали и центрифугировали в течение 20 мин. 10 мл отцентрифугированной вытяжки пропускали через колонку с гелем сефадекса G-25 и элюировали примеси 0,02 н. раствором серной кислоты. Эти опыты показали, что основная часть примесей элюируется из колонок раньше (8—11 фракций), чем изучаемые нами вещества. Однако небольшая часть примесей элюируется в тех же фракциях, в которых находятся барбитураты. Поэтому применить метод спектрофотометрии в УФ-области спектра для количественного определения барбитуратов, выделенных из биологического материала, становится невозможным. В связи с этим при дальнейших исследованиях использовали метод спектрофотометрии, основанный на измерении светопоглощения в видимой области спектра и фото-электроколориметрический метод.

После проведения указанных выше опытов мы использовали сефадекс G-25 для выделения гексобарбитала и этаминала из биологического материала. Для этого к 100 г «свежей» измельченной печени трупа прибавляли по 50 мл водных растворов гексобарбитала или этаминал натрия (1 мг/мл) и оставляли на сутки. Затем прибавляли 0,02 н. раствор серной кислоты, смесь доводили до рН 2,0—3,0 и поступали, как указано выше.

50 мл полученной вытяжки, содержащей барбитураты, вносили в колонку с гелем сефадекса G-25, и барбитураты элюировали 0,02 н. раствором серной кислоты. Первые 120 мл элюата отбрасывали, а последующие 160 мл (для гексобарбитала) или 200 мл (для этаминал-натрия) собирали в колбы. Для количественного определения барбитуратов их элюаты взбалтывали 2 раза с хлороформом (по 100 мл). От водной фазы отделяли хлороформный слой. Соединенные хлороформные вытяжки выпаривали досуха. Сухие остатки, содержащие этаминал, растворяли в 2 мл метанола, а содержащие гексобарбитал — в 4 мл хлороформа. К каждому из этих растворов прибавляли по 5 мл 0,125% раствора ацетата кобальта в метаноле, по 1 мл (для этаминала) или 0,8 мл (для гексобарбитала) раствора изопропиламина в метаноле (1:1) и хлороформ до 12 мл. Оптическую плотность окрашенных растворов измеряли при длине волны 565 нм (спектрофотометр СФ-4А, кювета 1 см), а также при помощи фотоэлектроколориметра ФЭК-М (светофильтр зеленый, кювета 20 мм). Количества выделенных барбитуратов рассчитывали по калибровочным графикам и пересчитывали на весь объем вытяжек.

Наши опыты показали, что указанным методом выделяется 44,0—47,2% гексобарбитала и 28,0—32,8% этаминала.

Выводы

1. Разработан метод очистки барбитуратных вытяжек из биологического материала, с помощью геля сефадекса G-25.
2. Указанным методом можно выделить 44,0—47,2% гексобарбитала и 28,0—32,8% этаминала.