Химико-токсикологический анализ имована в биологических объектах

Имован (Зопиклон, Zopiclon)  (R,S-6-(5-chloro-2-piridyl)-6,7-dihydro-7-oxo-5H-pyrrolo- |3,4-b| pyrazin-5-yl-4-methyl-1-piperazinecarboxylate относится к снотворным веществам короткого действия. По химической структуре имован не относится к производным бензодиазепина и барбитуратам. Это новый класс психотропных средств циклопирронов.

Имован производится компанией РОН-Пулен Рорен (Франция). Помимо снотворного эффекта проявляет успокаивающее,  анксиолитическое, пртивосудорожное и миорелаксирующее действие, последние два выражены в меньшей степени по сравнению с бензодиазепинами. Отсутствие сонливости и разбитости на утро выгодно отличает имован от бензодиазепинов и барбитуратов.

Терапевтическая доза для взрослых составляет 7,5 мг,  максимальный уровень в плазме достигается через 1,5 - 2 часа  и составляет в среднем после приема внутрь 3,75 и 7,5 мг  соответственно 30 и 60 нг/мл крови. Длительное применение не рекомендуется, курс лечения не более 4-х недель. Интенсивно метаболизируется тремя основными путями: декарбоксилированием, окислением и деметилированием.  Риск взаимодействия с другими веществами невелик.  45% имована связывается с белками плазмы. Имован характеризуется коротким периодом полужизни,   обычно 5,5 - 6 часов. Повторный прием препарата не сопровождается кумуляцией имована и его метаболитов. С мочой имован выводится до 80% в виде метаболитов, и менее 5%  в иеизменном виде.

При приеме имована, как и всех снотворных средств, следует остерегаться приема алкоголя и других тормозящих ЦНС средств (3).

Передозировка проявляется в виде различной степени угнетения ЦНС: от сонливости до комы. В качестве антидота рекомендуется флумазенил.

Имован - не стабилен в шелочной среде и нуклеофильных растворителях, таких как метанол и этанол. Стабильность несколько лучше в изопропаноле, ацетонитриле и толуоле (1,2,3)

Для экстракции имована из биологических объектов используют различные растворители при слабощелочном рН, в том числе изоамиловый спирт, диэтиловый эфир, толуол, бутилхлорид, этилацетат, гексан и др. Часто используют смеси растворителей (гексан - дихлорметан, 3:4).  Все эти растворители дают достаточно хороший выход. В последнее время  не рекомендовано применение  таких токсических или канцерогенных растворителей как хлороформ и бензол.

Описан случай отравления 72-летнего мужчины с раком легкого, принявшего 90 мг зопиклона (12 таблеток по 7,5 мг) с суицидной целью (1). Смерть наступила в промежутке между 4 и 10 часами  после приема. На исследование были направлены кровь, моча, желчь и внутриглазная жидкость.

Стандартный раствор золиклона,  1 мг/мл, готовили в ацетонитриле, в котором он стабилен не менее 2-х месяцев.  Контроль положительный на крови и моче готовили в концентрации 2 мг/мл с последующим разведением до содержания 1500, 1000, 500, 200, 100  нг/мл. Количественное определение имована в  крови и желчи замеряли  по калибровочной кривой, построенной с использованием стандартных растворов имована в крови, в моче и внутриглазной жидкости - по калибровочной  кривой, построенной с использованием стандартных растворов имована в моче. 

Методика. К 1 мл пробы в экстракционной пробирке 15х1,5 см добавили 10 мкл внутреннего стандарта p-Cl-Disopyramide с концентрацией 100 мкг/мл в метаноле,  800 мкл 1 М NaHCO3, (рН 9), 4 мл метил-терт-бутилового эфира и 2 мл метиленхлорида. Пробирки закрыли завинчивающейся крышкой с тефлоновой прокладкой, экстрагировали 15 мин на орбитальном встряхивателе, затем центрифугировали 5 мин. Органический слой перенесли в 5-и мл коническую пробирку и выпарили при 40°С на песчаной бане в токе азота. Остаток растворили в 100 мкл 0.1 н HСl и промыли от холестерина 5 раз порциями метил-терт-бутилового эфира по 250 мкл. Каждый раз встряхивали с водным слоем, центрифугировали и эфир отделяли  с помощью пастеровской пипетки и водоструйного насоса. Кислый водный слой затем подщелачили 100 мкл 1 М NaHCO3 (рН 9) и экстрагировали 2 мл метиленхлорида. Пробирку центрифугировали и верхний водный слой отделили на выброс. Метиленхлорид профильтровали через безводный сульфат натрия в чистую 5 мл коническую пробирку. После добавления 100 мкл этилацетата, метиленхлорид упарили до 25 мкл в токе азота и иссдедовали  на газовом хроматографе с масс-селективным детектором.

Имован не подвергается дериватизации, а его  N--десметил-метаболит может ацилироваться различными реагентами, гидрокси-метаболит дериватизируется с образованием триметилсилильных производных.

Для ВЭЖХ имована предложен метод (2) с УФ детектором при 305 нм,  подвижная фаза  ацетонитрил - 0,01 М NH4 H2O 4  + 0.05% N(CH3 )3 , 60 : 40, рН 6,8

В практике нашей лаборатории встретился случай смертельного отравления имованом. Из обстоятельства дела установлено, что женщина 43 лет поступила в больницу в 3 часа, в 11 часов скончалась. Накануне дома приняла 10 таблеток по 7,5 мг имована с суиццидной целью. Состояние тяжелое, рвота, заторможенность. В больнице промывали желудок, в промывных водах видели остатки  таблеток, но промывные воды не сохранили. На исследование в лабораторию доставили кровь, ткани печени, почки и стенки желудка без содержимого.

Изолирование имована проводили ацетонитрилом при рН 9-9,4 с  последуюшей очисткой эфиром  из кислого водного извлечения. Органическую фазу испарили при 40°С досуха, остаток растворили в ацетонитриле и исследовали.

Для обнаружения имована использовали хроматографию в тонком слое сорбента, хроматомасс-спектрометрию, высокоэффективную жидкостную хроматографию.

Для ТСХ использовали пластинки “Сорбфил” в системах растворителей:

1. Метанол - аммиак (100 :1,5). Величина Rf =0,55
2. Этилацетат -  метанол - 25% аммиак 85 : 10 : 5). Величина Rf=0,32

Детектировали:

• 1) Реактивом Драгендорфа, модифицированным по Мунье + 20% серная кислота.
• 2) Подкисленным раствором иодплатината.
• 3) 0,5% водный раствором Fast Black K (Черный прочный К) - красноватое окрашивание.

Идентификация имована проводилась на газовом хроматографе Agilent 6890 с масс-селективным детектором 5972.  Хроматограммы с масс-спектрами стандартного раствора имована и имована, извлеченного из крови и печени  показаны на рис. 1,2,3.

Анализ материала методом ВЭЖХ проводили на отечественном микроколоночном хроматографе «Милихром – 4» с УФ детектором со стандартной металлической колонкой (80х2 мм), заполненной обращенно-фазным сорбентом Сепарон С18 (7 мм). Оптимальной подвижной фазой оказалась следующая: ацетонитрил - 0,05 М двузамещенный фосфат аммония - 0,5 М ортофосфорная кислота - диэтиламин (40:55:3:2), рН 6. Скорость потока - 200 мкл/мин, длина волны - 300 нм.

Сухой остаток хлороформного экстракта растворили в 1 мл подвижной фазы,  объем вводимой пробы -25 мкл. Идентификация проводилась по сопоставлению времен (объемов) удерживания с параметрами метчика имована. Также испольэовались данные спектральных соотношений при двух значениях длин волн (210 и 300 нм).

Количественное определение имована в экспертном материале проводили  в этих же условиях. Для определения линейности была проведена градуировка в диапазоне концентраций 10 - 100 мкл/мл.Значение предела обнаружения имована на хроматографе “Милихром” составило 1 - 2 нг.

В крови и печени обнаружен имован (зопиклон). Содержание имована в исследуемой крови, определенное на жидкостном хроматографе “Милихром” составило 1,3 мг/л. По литературным данным (2,3) летальная концентрация имована составляет от 0,4 до 1,16 мг/л крови (4 случая) ВЭЖХ методом.

Выводы

1. Имован,  являясь снотворным препаратом короткого периода действия, имеет побочные эффекты, включая привыкание, взаимодействие с другими  психотропными препаратами,  ухудшение психомоторной функции, памяти и риск передозировки.
2. Описан случай из практики обнаружения, идентификации и количественного определения имована в биоматериале. Использование ВЭЖХ позволяет проводить анализ при комнатной температуре, повышает чувствительность определения неустойчивых и термолабильных веществ, каким является имован.