Подтверждение  11-нор-9-карбокси-∆9-ТГК в моче методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором

Разработан  метод с использованием хромато-масс-спектрометрии для подтверждения и количественного определения 9-карбокси -11-нор-∆⁹-тетрагидроканнабинола в моче  для выполнения серийных анализов, с целью подтверждения положительных образцов мочи после предварительного скрининга иммунным методом на наличие каннабиноидов  Предложены оптимальные условия щелочного гидролиза  для пробоподготовки   биообъекта. В качестве предварительного метода скрининга на наличие 9-карбокси -11-нор-∆⁹-тетрагидроканнабинола предложен хорошо зарекомендовавший в рутинном химико-токсикологическом анализе метод флюоресцентно-поляризационного иммуноанализа.

В настоящее время всё чаще на исследования поступают объекты, такие как моча и кровь с целью обнаружения каннабиноидов.  Из практики Бюро судебно-медицинской экспертизы Министерства здравоохранения Московской области, в основном, это случаи, связанные с живыми лицами, задержанными с наркотиками, а также совершившими ДТП или просто задержанными с целью подтверждения или исключения состояния наркотического опьянения.

Под термином каннабиноиды подразумевается группа соединений, полученных из растения конопли, основнымм действующим и психоактивным компонентом которых является тетрагидроканнабинол (ТГК).

ТГК интенсивно метаболизируется и  с мочой выводится в неизменном виде лишь 1% ТГК. При курении метаболизм начинается в лёгких, а при приёме внутрь – орально – это происходит в печени. Через 72 часа после курения приблизительно 50% вдыхаемого ТГК выделится  (в виде метаболитов), а оставшиеся 50% распределяется в организме, в большей мере адсорбируется жировой тканью и медленно выделяется  в течение последующих дней. Выводится главным образом с мочой. Идентифицировано свыше 20 метаболитов ТГК. Главным метаболитом кислого характера является 11-нор-∆⁹-тетрагидроканнабинол-9-карбокси кислота, которая конъюгируется  и в виде моно и ди-глюкуронидов выделяется с мочой.

Анализ мочи имеет преимущество в детектировании метаболитов ТГК, в связи с тем, что основной метаболит можно обнаружить  на протяжении довольно продолжительного периода времени после употребления наркотика. Выделение  9-карбоки–ТГК после однократного потребления отличается от такового у хроников. После однократного потребления метаболит может быть определён  в моче в течение 1-3 дней, в то время как у хронических курильщиков метаболит  может быть определён в течение 3-х –4-х недель после последней дозы. Идентификация 11-нор-∆⁹-тетрагидроканнабинол-9-карбокси кислоты в моче считается наилучшим показателем потребления каннабиноидов. 

Результат предварительного метода анализа на каннабиноиды положителен,  если концентрация основного аналита 11-нор-∆⁹-тетрагидроканнабинол-9-карбокси кислоты  в моче  превышает  50 нг/мл – величину пороговой концентрации для предварительного  метода анализа.

В качестве предварительных методов  используют иммунные методы скрининга. Широко применяется радиоиммунный анализ (RIA), энзиматический иммунноанализ (EIA), флюоресцентно - поляризационный иммунноанализ, с дальнейшим подтверждением положительных проб более специфичным методом, таким как, газовая хроматография с масс-селективным детектором.

Рис.1 Метаболизм ТГК

В данной работе для предварительного скрининга применялся иммунный анализатор фирмы Abbot AxSYM  - ПФИА - флюоресцентно-поляризационный иммуноанализ.

Как  для анализа на каннабиноиды, так и для анализа на многие другие наркотические, лекарственные и психотропные препараты в моче, преимуществами использования данного анализатора являются:

• - стабильность калибровочных графиков
• - возможность получения полу-количественных результатов
• - получение мгновенных результатов на широкий спектр наркотических и психотропных веществ, что особенно важно в экстренных случаях
• - простота и надёжность в  использовании
• - отсутствие пробоподготовки и органических растворителей.

Использования этого анализатора  в рутинном анализе образцов мочи на наркотические и психотропные вещества значительно снижает трудозатраты.

Метод ГХ-МС в наши дни является основным аналитическим методом для подтверждения  и количественного определения наркотических веществ.

Для выполнения серийных анализов, с целью подтверждения положительных образцов после предварительного скрининга методом ПФИА на наличие каннабиноидов,  был разработан  ГХ-МС метод для подтверждения и количественного определения 9-карбокси- ТГК на уровне пороговой концентрации  15 нг/мл (для подтверждающего метода).

Целью данного исследования была разработка  надёжного, высоко чувствительного, воспроизводимого, не дорогого и точного метода. Стоит отметить, что до этого метод ТСХ использовался для конечного подтверждения 11-нор-∆⁹-тетрагидроканнабинол-9-карбокси кислоты в моче.

Таблица 1.  Преимущества и недостатки двух методов, используемых в качестве подтверждающих

Преимущества метода ГХ-МС	Преимущества метода ТСХ
Надёжный метод (наличие спектра для идентификации)	Недорогой метод
Высокая чувствительность	Быстрый в исполнении для серии образцов
Прост в исполнении для серии образцов (auto-injection)
Недостатки метода ГХ-МС	Недостатки метода ТСХ
Дорогой (в сравнении с ТСХ)	Меньшая чувствительность (в сравнении с ГХ-МС)
Дополнительное время и средства для поддержки ГХ-МС	Не надёжный (нет уверенности в интерпретации или субъективная интерпретация)
	Вредный для здоровья персонала (нанесение экстрактов на пластинки)

Количественное определение и интерпретация результатов при использовании ГХ-МС метода анализа требует использование внутренних стандартов – стандартов, добавленных к образцу до процедуры экстракции. Внутренний стандарт должен иметь  сходства с “исследуемым аналитом”. Он должен экстрагироваться, дериватизироваться и анализироваться  при тех  же условиях и хорошо разделяться во время хроматографической процедуры. При количестенном определении методом ГХ-МС наиболее широко используют дейтерированные  аналоги, но в основном только для количественного определения в крови, т.к.  они очень дороги.

Количественный метод ГХ-МС подтверждения  9-карбокси- THC в моче необходим в лаборатории для того, чтобы  подтверждать образцы, концентрация, которых по результатам предварительного метода анализа превышает немного пороговую концентрацию для  предварительного метода, т.е. 50 нг/мл. На практике, именно такие образцы и вызывают наибольшие трудности, особенно при подтверждении методом ТСХ (метод не столь чувствителен при очень низких концентрациях).

В качестве внутреннего стандарта был взят метаквалон.

Таблица 2.  Метаквалон, как внутренний стандарт. Преимущества и недостатки

Преимущества	Недостатки
хорошие хроматографические свойства + различие в RI =>RT	другая структурная формула
приблизительно одинаковые условия экстракции	не образует производных (в том числе с MSTFA)
метаквалон в объектах, присланных целенаправленно для анализа на каннабиноиды, практически не встречается,	однако встретить его возможно

                       

Экспериментальная часть

Оборудование. Газовый хроматограф HP 5890 с масс-селективным детектором HP5971A. Капиллярная кварцевая колонка HP-5MS 12 м х 0,2 мм х 0,33 мкм. Скорость потока газа носителя – гелия 1 мл/мин. без деления потока. Температура колонки:   начальная температура  100ºС  (2 мин), нагрев до 275ºС  со скоростью  30ºС/мин. Температура инжектора  260ºС. Температура интерфейса  280ºС. Режим работы МСД – полное сканирование от 200 до 500 аем.

Пробоподготовка. Использовали  процедуру жидкость-жидкостной экстракции.

В экстракционную пробирку с притёртой пробкой из толстостенного стекла (чтобы использовать для центрифугирования) помещали  2 мл анализируемой мочи, добавляли внутренний стандарт – метаквалон (из расчёта 100 нг/мл), 200 мкл 1М NaOH. Пробирку тщательно закрывали притёртой пробкой и специальным запирающим устройством, выдерживали 20 мин в термоблоке при 60ºС и при естественных условиях остужали до комнатной температуры. Затем, к содержимому добавляли 500 мкл 2М HCl и 4 мл гексана. Содержимое  также тщательно закрывали и помещали в горизонтальный шейкер (300 колебаний/мин). Встряхивали в течение 5 мин в режиме 300 колебаний / минуту. Затем центрифугировали 30 мин в режиме 4000 об/мин.  Ограническую фазу переносили пастеровской пипеткой в 4 мл флаконы с завинчивающейся крышкой (не весь орг. слой @ 3.5 мл, чтобы избежать попадания в экстракт грязи ).  Испаряли органическую фазу досуха  для этого помещали флаконы в концентратор (TºС  нагревательного блока   40ºС) под ток азота (около 10-15 мин)).  К сухому остатку во флаконе  добавляли 50 мкл MSTFA, флакон тщательно закрывали завинчивающейся пробкой интенсивно встряхивали на мини шейкере и помещали его в термоблок на 30 мин  при 60ºС. После того, как содержимое остывало до комнатной температуры, его переносили в 2 мл  виалу с  конической вставкой.  Виалу закрывали металлическим колпачком и закатывали   кримпером.

С каждой серией исследуемых объектов – параллельно анализировали (выполняли всю процедуру экстракции, дериватизации и ГХ-МС анализа) контроль положительный (2 мл мочи отрицательной с добавкой 9-карбокси ТГК в концентрации 15 нг/мл)

Были реализованы различные условия щелочного гидролиза: варьировали условия и время проведения гидролиза мочи человека, курившего марихуану. После предварительного исследования методом ПФИА, результат можно было охарактеризовать как положительный, т.к. найденная концентрация превысила пороговую концентрацию для  предварительного метода, т.е. 50 нг/мл и составила 77 нг/мл,. Результаты количественного определения 9-карбокси-ТГК в моче (N=5) в зависимости от условий и  времени проведения гидролиза, приведены в табл. 3. В столбце V представлено среднее значение  концентрации (N=5)

Таблица 3.   Условия и время проведения гидролиза для последующей экстакции 9-карбокси-ТГК

№	С ТГК-СООН, нг/мл	Условия гидролиза	Время гидролиза при 60ºС, t, мин	С (ГХ-МС) нг/мл	С (ПФИА) нг/мл
1	контроль «+» [15]	+200мкл NaOH 1N +500 мкл HCl 2N	-	15	-
2	[х]3	+200мкл NaOH 1N +500 мкл HCl 2N	10	19.4	77
3	[х]3	+200мкл NaOH 1N +500 мкл HCl 2N	20	46.7	77
4	[х]3	+200мкл NaOH 1N +500 мкл HCl 2N	60	51.6	77
5	[х]3	+100мкл NaOH 1N +250 мкл HCl 2N	20	1.5	77
6	[х]3	+300мкл NaOH 1N +500 мкл HCl 2N	20	40.3	77

Из выше представленных результатов можно сделать вывод, что предложенный к использованию метод экстракции 9-карбокси-ТГК из мочи (в таблице №3 - метод №3)   оптимален для подтверждения и количественного определения.

Представлены хроматограммы  объекта, направленного на подтверждение после предварительного скрининга  (С=103,4 нг/мл)

Рис. 2.  Фрагмент хроматограммы и масс-спектра реального образца № 3322 мочи человека, курившего марихуану

Рис. 3. Фрагмент хроматограммы и масс-спектра карбокси-ТГК 2ТМС реального образца № 3322 мочи человека, курившего марихуану с экстракцией по характеристическим ионам

В таблице 4 представлена форма протокола проведения анализа

Таблица 4. Протокол проведения анализа

Метод	Подтверждение 11-нор-9-карбокси-∆9-ТГК методом ГХ-МС
Анализ	11-нор-9-карбокси-∆9-ТГК (основной метаболит ТГК в моче)				моча
Информация	THCCOOH_conf.doc		Метод 1	действует с:	«ДАТА»
Объект:		моча 2 мл
Контроль отрицательный:		моча отрицательная (бланк)  2 мл
Контроль положительный:		моча (бланк) 2 мл + 30мкл стандартного раствора ТГК-COOH в метаноле (1нг/мкл)
Внутренний стандарт:		20 мкл раствора метаквалона в метаноле (10нг/мкл)
Реактивы:		NaOH 1М, HCl 2М / н-гексан
Посуда:		пробирки (10 мл) для экстракции толстостенные с притёртой пробкой, пипетки полипропиленовые, градуированные 3мл, пипетки пастеровские, флаконы с завинчивающейся крышкой на 4 мл, пипетки фиксированного и переменного объёмов от 100-1000 мкл, шприцы 50 мкл –2, виалы 2 мл, вставки конические в виалы, крышки для виал 11 мм.
Аппаратура		шейкер горизонтального типа встряхивания, центрифуга до 5000 об/мин, концентратор проб с термоподогревом и устройством для подачи тока азота, термоблок, минишейкер типа Vortex,  кримпер ГХ-МС: HP GC:  5890 / MS5971A
Метод:		THCCONF (метод fullscan m/z 200-500)
Инструкция оператора         Экстракция: - В 10 мл пробирку добавить 2 мл мочи, 20 мкл внутреннего стандарта и 200 мкл NaOH 1М - Выполнить ту же процедуру для контролей положительного и отрицательного - Гидролизовать 20 мин 60⁰С - Остудить до комн.темп. - Добавить 500 мкл HCl 2М - Экстрагировать 4 мл гексана (горизонтальный шейкер 5 мин.) - Центрифугировать 3 мин. 4000 об./мин. - Перенести органическую фазу в 4 мл флакон и испарить при 40ºС под током азота   Дериватизация: - Добавить к сухому остатку 50 мкл MSTFA и тщательно закрыть крышкой - Выдержать 30 мин при 60ºС - Перенести в 2 мл виалу с конической вставкой, тщательно закрыть  - Ввести 2 мкл в ГХ-МС, используя метод THCCONF   Идентификация и количественное определение: - Идентификация ТГК-СООН-2ТМС по  МС-спектру с  RT 9.3 - Количественное определение, используя функции Quantitate и Calculate  Report   Предел обнаружения (LOD) 1-2 нг ТГК-СООН /мл Предел определения (LOQ) 5 нг ТГК-СООН / мл Линейность в пределах 5 - 1000 нг/мл Пороговая концентрация (проба считается положительной)     15 нг/мл Критерий приемлемости количественного результата для данного метода: результат  контроля положительного  14.5±3 нг/м

Калибровочный график был построен на результатах анализа образцов мочи (2 мл), не содержащих каннабиноидов с добавками 9-карбокси-ТГК в различной концентрации (5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 и 1000 нг/мл). В пределах  5-1000нг/мл наблюдалась линейность.

Предел обнаружения (LOD) 1-2 нг ТГК-СООН /мл

Предел определения (LOQ) 5 нг ТГК-СООН / мл

Статистические данные представлены в табл. № 5.

Среднее арифметическое (`Х), стандартное отклонение (S) и стандартное относительное отклонение (RSD %) были установлены после анализа образцов мочи (2 мл) с добавкой 9-карбокси-ТГК на уровне пороговой концентрации  - 15 нг/мл.

Таблица 5.  Статистические данные

	С ТГК-СООН, нг/мкл	С ТГК-СООН, нг/мкл ГХ-МС	d	%RE
1	15	15	0.32	2.2
2	15	14,8	0.52	3.6
3	15	14,9	0.42	2.9
4	15	14,3	0.18	1.2
5	15	13,4	1.08	7.5
	`Х	14.48
	S	±0.66
	RSD %	4.6%

• t = 2.776 (табл. величина при P = 95%) , n = 5
• S = 0.66;    Доверительный интервал      Δ`Х= t x S/√n
• Δ`Х =  ± 0,82         14.48  ± 0,82 (13,66 – 15,3)

Была создана стандартная форма рапорта. 

Для того, чтобы оценить метод было проанализировано около 70  образцов мочи. Корреляцию между полученными   и ожидаемыми результатами для контрольных образцов мочи и соответствие между результатами предварительного скрининга методом  ПФИА  и результатами  подтверждающего метода  можно увидеть в представленной таблице № 6.

Таблица 6. Случаи из практики

I. С < С cut-of (ПФИА)

	№ образца	ГХ-МС калибр.гр. 15 нг/мл	ГХ-МС калибр.гр.  5-1000 нг/мл	ПФИА нг/мл
1	2935	10.5	10.7	37
2	3283	-	-	23.9
3-10	…..	-	-	20-40
11	3278	25.5/28.3		29.25
12	2483*	-	-	-

**  RT Диклофенак-H₂O TMS (RI = 2170) ≈ RT Метаквалон (RI = 2155)

II. С cut-of (ПФИА) < С < 135 нг/мл

		C, нг/мл
	№ образца	ГХ-МС калибр.гр. 15 нг/мл	ГХ-МС калибр.гр. 5-1000 нг/мл	ПФИА нг/мл
13	2478	30.6	35.4	110.0
14	2480	17.2	20.7	60.0
15	2936	15.4	15.3	67.0
16	2989	45.2	42.0	128.0
17	2572	27.3	33.3	58.8
18	2719	18.9	20.6	90.6
19	2721	44.7	51.8	114.7
20	3259	68.7	86.0	118.5
21	3322	74.6	98.2	103.4
22	3588	48.7	42.4	130.0
23	2706	46.7	59,8	77

 

III. C > 135 ng/mL

		C, нг/мл
	№ образца	ГХ-МС калибр.гр. 15 нг/мл	ГХ-МС калибр.гр. 5-1000 нг/мл	ПФИА нг/мл
25	2476	61.4	64.8	> 135.0
26	2913	373.8	432.5	> 135.0
27	2917	145.9	161.7	> 135.0
28	2938	62.9	70.5	> 135.0
29	3034	466.8	423.5	> 135.0
30	3154	613.0	781.2	> 135.0
31	2655	72.0	91.8	> 135.0
32	2710	580.3	768.2	> 135.0
33	3473	2735.1	2519.6	> 135.0

В образце мочи №2483 случай  №12* был найден диклофенак, время удерживания которого совпадает с временем удерживания нашего аналита. В случае положительного результата на наличие каннабиноидов, полученного методом ПФИА, количественное определение было бы затруднено.

Выводы:

1. Разработан метод подтверждения 11-нор-∆9-тетрагидроканнабинол-9-карбокси кислоты в моче. Предложенный  метод   обеспечивает надёжное и точное подтверждение 11-нор-∆9-тетрагидроканнабинол-9-карбокси кислоты и может быть использован, как количественный метод.
2. Предложенный метод пробоподготовки для подтверждения 11-нор-∆9-тетрагидроканнабинол-9-карбокси кислоты хорошо воспроизводим, быстр в исполнении, что особенно важно в рутинном химико-токсикологическом анализе.
3. Установлены оптимальные условия проведения щелочного гидролиза для малых проб мочи.
4. Показаны преимущества использования флюоресцентно-поляризационного иммуноанализатора AxSYM (Abbot) в рутинном химико-токсикологическом анализе.