Обнаружение и определение лекарственных веществ нейтрального и основного характера в крови (сыворотке) газохроматографическим методом с использованием азотно-фосфорного детектора

Предложен газохроматографический метод с использованием азотно-фосфорного детектора для качественного и количественного анализа лекарственных веществ нейтрального и основного характера в крови (сыворотке). Предложен способ экстракции  лекарственных  веществ  из 1 мл крови.

1.Введение.

В настоящее время уже нет необходимости говорить о возможностях и роли газовой хроматографии в современном анализе. Она прочно заняла ведущее место среди наиболее эффективных методов анализа и широко применяется в судебно-химических и химико-токсикологических лабораториях [1,3]. Газовая хроматография с использованием азотно-фосфорного детектора является высоко чувствительным, селективным методом, позволяющим обнаруживать и определять лекарственные вещества на уровне терапевтических концентраций в биопробах человека [7,8].

При проведении судебно-химических экспертиз большое значение имеет количественное определение лекарственного вещества в биообъектах. Количественное определение позволяет дифференцировать терапевтическую, токсическую и летальную концентрации или установить влияние лекарственных, в том числе психотропных веществ, на поведение человека. Наилучшим объектом для исследования является кровь.

Изучив работы [4,7,8], посвященные газохроматографическому анализу лекарственных веществ, мы остановились на газохроматографическом методе определения лекарственных веществ в крови и сыворотке с использованием азотно-фосфорного детектора.

Целью нашей работы была разработка метода идентификации и количественного определения широкого спектра лекарственных веществ в крови и сыворотке, который мы могли бы использовать в рутинном анализе.

2.Экспериментальная часть.

2.1. Объект исследования.

Объектами являются цельная кровь или сыворотка. В качестве контроля использовали бланковую плазму – плазму, не содержащую лекарственных веществ (плазму получали из отделения переливания крови в МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского и анализировали на наличие лекарственных веществ).

2.2. Стандарты и реактивы.

Трис-гидроксиметил-аминометан (трис-буфер) С₄ Н ₁₁ NO₃ 1М, бутилацетат, дифениламин в метаноле (ДФА - внутренний стандарт)  20 мкг/мл, стандартные растворы лекарственных веществ в концентрации 1мг/мл в метаноле.

2.3. Оборудование.

Газовый хроматограф Agilent Technologies 6890N с азотно-фосфорным детектором, смешиватель вибрационный “IKA VIBRAX”, центрифуга “Jouan”.

2.4. Условия газохроматографического анализа.

Колонка хроматографа капиллярная HP-5 (5% фенилметилсилоксан) (30м х 0.32мм x 0.25 мкр м). Начальная температура колонки 60⁰С. Время выдержки при начальной температуре –0.70 мин. Подъем температуры в диапазоне 60-140⁰С –20⁰/мин, 140-290⁰С –10⁰/мин. Время выдержки при конечной температуре 9,5мин. Температура инжектора 270⁰С. Режим без деления потока. Температура детектора 300⁰С. Начальный поток 7.4мл/мин. Средняя скорость 84см/сек. Объем вводимой пробы 1мкл.

2.5. Пробоподготовка.

В  стеклянную  пробирку  на  10 мл вносили  1 мл  крови,  добавили 50 мкл ДФА, 300 мкл трис-буфера и интенсивно встряхнули на вибро-встряхивателе. Образец экстрагировали 300 мкл бутилацетата (2 минуты) и центрифугировали  в течение 5 минут при 4000об/мин. 150 мкл органической фазы переносили в виалу с конической вставкой и 1 мкл извлечения вводили в испаритель хроматографа.

2.6. Качественный анализ.

Идентификацию пиков, полученных при анализе пробы, производили по времени удерживания. Параллельно с исследуемым образцом анализировали контроли – положительный (извлечение из плазмы, содержащей исследуемое лекарственное вещество) и отрицательный (извлечение из бланковой плазмы) [4].

2.6. Количественный анализ.

Количественный анализ проводили с использованием метода внутреннего стандарта.

В качестве внутреннего стандарта нами был выбран дифениламин (ДФА) т.к. он не встречается в объектах, направляемых на исследование, имеет хорошие хроматографические свойства и экстрагируется в условиях данного метода.

Для построения калибровочного графика использовали бланковую плазму с добавлением стандартных растворов лекарственных веществ на уровне терапевтических, токсических и летальных концентраций [5,6].

Для расчёта концентрации лекарственных веществ в исследуемых образцах использовали программное обеспечение ChemStation, позволяющее строить калибровочные графики по данным калибровочных таблиц.

3. Результаты

Нами были проанализированы 20 веществ. Ниже приведены времена удерживания некоторых из них:

1. Амитриптилин                  12.68
2. Диазепам                            14.75
3. Дифениламин                    7.22
4. Димедрол                           9.73
5. Клозапин                           17.87
6. Нортриптилин                   12.82
7. Но-шпа                               17.90
8. Тизерцин                            15.40

На рис. 1 представлена хроматограмма тестовой смеси, в состав которой входят ДФА, димедрол, амитриптилин, нортриптилин в концентрации 2нг/мкл каждого.

Рис. 1. Хроматограмма тестовой смеси.

Пределы обнаружения, определения, линейность для некоторых из исследованных нами веществ представлены в табл. 1.

Таблица 1

Предел определения, предел обнаружения, линейность.

На рис. 2 показан калибровочный график для димедрола.

Рис. 2. Калибровочный график.

Статистическая обработка результатов [2].

Статистическая обработка результатов для исследованных нами лекарственных веществ приведена в табл. 2.

Таблица 2.

Результат измерения (х_i), среднее значение (`Х), стандартное отклонение (S), относительное стандартное отклонение (RSD[%]), доверительный интервал (`Х±Δ`Х) при заданной вероятности (Р).

4. Обсуждение результатов.

Предложен метод для скрининга и количественного определения разных групп лекарственных веществ нейтрального и основного характера. Метод обладает высокой чувствительностью и позволяет определять терапевтические концентрации веществ в 1 мл крови.

Применяемые в настоящий момент методы пробоподготовки биопроб требуют большую размерность пробы, а значит, и большого количества высокотоксичных растворителей, работа с которыми вредит здоровью сотрудников и загрязняет окружающую среду. В предлагаемом методе используется всего лишь 1 мл пробы и расходуется 300 мкл растворителя. Процедура пробоподготовки занимает мало времени, что особенно важно при экспресс-диагностике острых отравлений.

Метод надежен, селективен, обладает высокой воспроизводимостью. Соблюдается линейность при построении калибровочных графиков для всех исследованных веществ от терапевтического значения, до летального. Специфичность метода заключается в том, чтобы безошибочно отдифференцировать анализируемое вещество от других компонентов, в том числе от эндогенных компонентов. Чтобы удостоверится в отсутствии влияния биологической матрицы, (крови) были проанализированы отрицательные бланковые пробы.

Было установлено, что времена удерживания исследуемых веществ хорошо воспроизводятся в условиях метода.

Метод количественного определения лекарственных веществ в крови применен при исследовании экспертного материала. Нами был проведен качественный анализ и количественное определение лекарственных веществ в 50 экспертных случаях. В табл.3 представлено несколько из них.

Таблица 3

Случаи из практики.

5. Выводы

1. 1.Предложен газохроматографический метод с использованием азотно-фосфорного детектора для качественного и количественного определения в крови (сыворотке) лекарственных веществ нейтрального и основного характера.
2. Метод высоко чувствителен, специфичен, хорошо воспроизводим и не требует большой размерности пробы.
3. Схема пробоподготовки биообъекта рациональна, воспроизводима, не требует больших объёмов растворителя при экстракции и проста в исполнении, что очень важно в рутинном судебно-химическом анализе. В процедуре пробоподготовки сведены до минимума потери при экстракции.
4. Метод позволяет определить терапевтические концентрации лекарственных веществ в 1 мл крови также хорошо, как и концентрации в случаях с летальным исходом.
5. Нами планируется проводить дальнейшую исследовательскую работу для создания базы данных для других лекарственных веществ, встречающихся в экспертной практике.