Плоидометрическое исследование в судебной медицине с целью диагностики гипотермии

Судебно-медицинская экспертиза смертельной гипотермии традиционно основывается на выявлении комплекса критериев, включающего признаки, регистрируемые при осмотре трупа на месте его обнаружения, макроскопические и микроскопические признаки, а также ряд лабораторных показателей. В судебно-медицинской практике важной проблемой остается определение темпа переохлаждения организма в случаях смерти от гипотермии с учетом состояния погибшего и условий, в которых он находился в момент переохлаждения.

Известно, что в результате действия на организм низкой температуры в 85-90% случаях летальных исходов в слизистой оболочке желудка обнаруживают мелкоточечные кровоизлияния (пятна Вишневского). Они появляются через 1 – 2 часа после переохлаждения организма, но в большинстве случаев - спустя 6 – 8 часов. Иногда они обнаруживаются и через 47-54 дня после перенесенной человеком холодовой травмы (Г.Н.Клинцевич,1973). Кровоизлияния в слизистой оболочке желудка могут отсутствовать в случаях, когда переохлаждение организма наступает в короткие сроки.

В ответ на воздействие разнообразных внешних факторов, приводящих к смерти, в тканях и органах возникают прижизненные реактивные процессы, выраженность которых во многом зависит от силы и продолжительности действия раздражающего фактора (Науменко В.Г., Митяева Н.А., 1980). Отмечено, что наиболее информативным показателем изменений клеточной активности органов человека является объем ядра клеток. Этот признак определяется и в тех случаях, когда изменения структурных и гистохимических показателей еще не выявляются (Падеров Ю.М., 1994, 1999). Количественная характеристика изменений клеток и ядер различных тканей при гистологических исследованиях дает возможность судить об изменениях в клеточном составе различных тканей и о пролиферативной активности ее клеточных популяций (Автандилов Г.Г. 1990, 2002).

Цель настоящего исследования – изучение диагностического значения изменений пролиферативной активности клеток слизистой оболочки желудка в случаях смерти от гипотермии для судебно-медицинской оценки темпа переохлаждения.

Материал и метод. Материалом для исследования являлась слизистая оболочка желудка 54 трупов лиц обоего пола, погибших в возрасте 18-74 лет от гипотермии на территории Республики Саха (Якутия) в 2001-2003 г. В преобладающем большинстве случаев давность смерти не превышала одних суток. В каждом наблюдении изучали факторы, влияющие на темп переохлаждения (температура воздуха, состояние одежды, возраст, сопутствующие заболевания, концентрация этанола в крови и моче и др.). Наиболее частым способствующим наступлению смерти фактором явилось алкогольное опьянение различной степени (85%), в ряде случаев в сочетании с увлажнением поверхности тела и физическим переутомлением. Смерть наступала преимущественно в фазе элиминации алкоголя  при концентрации его в моче равной 1,6%₀ - 4,7%₀ и в крови - 0,8%₀ - 3,1%₀.

В зависимости от действия на организм  комплекса способствующих наступлению смерти факторов (температура окружающей среды, продолжительность воздействия низкой температуры, состояние организма и условия, в которых он находится) исследуемые наблюдения подразделены на 2 группы:

• 1 группа - с «быстрым» темпом переохлаждения (6 наблюдений);
• 2 группа - с «медленным» темпом переохлаждения (14 наблюдений).

Материал для гистологического исследования иссекали из слизистой оболочки желудка в области мелкоточечных кровоизлияний (пятен Вишневского).

В группу сравнения включили случаи смерти лиц, погибших от колото-резаного ранения (2), механической асфиксии (1), острого отравления этиловым алкоголем (1) и алкогольной кардиомиопатии (1), а в группу контроля – результаты прижизненного биопсийного материала неизмененной слизистой оболочки желудка (10 наблюдений).

Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, заливали в парафин, срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, дополнительные срезы толщиной 8 мкм для выявления содержания ДНК окрашивали по методу Фёльгена (без докраски фона). Главным требованием к микроспектрофотометрическому исследованию является сохранение стандартной толщины и окраски изучаемых срезов (Г.Г. Автандилов,1984).

При обзорном патогистологическом исследовании выделяли типичные участки гистологического препарата: с нормальным строением (по 3 слоям) и наиболее измененные участки (по 3 слоям) – очаги некроза и кровоизлияний (пятна Вишневского). После обычного патогистологического исследования в 45 наблюдениях на типичных участках гистологического среза провели сравнительную микроспектрофотометрию ядер клеток с использованием анализатора изображения «Имаджер-ЦГ» с версией программы для плоидометрии «Avtan-San» (Г.Г.Автандилов, К.Б.Саниев,2001). Условия освещения при микроскопии и пороги измеряемых объектов сохраняли одинаковыми для всех исследуемых гистологических препаратов.

При проведении сравнительной микроспектрофотометрии оценивали интегральную яркость ядер (сумма яркостей всех пикселей измеряемого объекта), отражающую содержание ДНК в ядрах клеток. Определяли значения «тканевого стандарта» плоидности, установив среднее значение интегральной яркости ядер малых лимфоцитов в том же срезе, который соответствует двойному набору хромосом (2с). Далее все ядра клеток слизистой оболочки желудка автоматически относились к половине стандарта плоидности (1с). Показатели плоидности и площади ядер выводились в таблицы и на монитор в виде гистограмм распределения ядер по значениям плоидности и самих ядер клеток препарата в псевдоцветах зависящих от значений плоидности. Для оценки реактивных изменений в эпителии слизистой оболочке желудка определяли показатель пролиферативной активности (ПА) клеток по превышению среднего содержания ДНК в ядрах изучаемых клеток уровня диплоидного набора (Г.Г. Автандилов, 1984;1990;2002).

Полученные данные подвергали статистической обработке с использованием средней арифметической (М), средней взвешенной (М_в), среднего квадратического отклонения (σ) и ошибки  выборки (m).

Результаты и обсуждение. Согласно результатам измерения 139 малых лимфоцитов в срезах ткани слизистой оболочки желудка средний показатель интегральной яркости оказался равным 32000 отн.ед., соответствующий диплоидному набору (2с). За «тканевый стандарт плоидности» принимали половину этого показателя, т.е. 16000 отн.ед. Плоидометрическому исследованию подвергли 11918 ядер клеток слизистой оболочки желудка групп контроля, сравнения и групп лиц, погибших от гипотермии.

Средневзвешенная плоидность ядер клеток для нормальной слизистой оболочки желудка  в контрольной группе составила 2,36±0,001с, пролиферативная активность эпителия 0,36, а в группе сравнения средневзвешенная плоидность ядер составила 2,41±0,001с, пролиферативная активность эпителия – 0,41. При этом все изучаемые клетки в данных группах находились только в диплоидной части популяции (1с-4с). (таблица 1)

Таблица. 1. Характеристика показателей пролиферативной активности  клеточной популяции слизистой оболочки желудка в группах контроля и сравнения.

В группе наблюдений с «быстрым» темпом переохлаждения (1 группа) средневзвешенная плоидность ядер составила 2,35±0,001с, пролиферативная активность клеток – 0,35, т.е. не превышает этот показатель в нормальной слизистой оболочке желудка. Количество клеток находившихся в диплоидной части популяции составило 87±0,59%,  а доля клеток в полиплоидной части (> 5c) – 13 ± 0,59%. При этом доля клеток с признаками некроза составила 14% от всех исследуемых клеток.

В группе наблюдений с «медленным» темпом переохлаждения (2 группа) отмечено увеличение средневзвешенной плоидности ядер до 2,7±0,0006с и пролиферативной активности эпителия до 0,7. Изучение состава клеточной популяции дает следующие результаты: количество клеток находящихся в диплоидной части популяции составило 78±0,51%, а в полиплоидной части – 22±0,51% (таблица 2). Отмечается уменьшение некротических изменений клеток в 2 раза, доля которых составила 7% от всех исследуемых клеток.

Таблица. 2. Характеристика показателей пролиферативной активности  клеточной популяции слизистой оболочки желудка в группах с «быстрым» и «медленным» темпом переохлаждения организма. 

Из полученных данных следует, что в условиях «быстрого» темпа переохлаждения организма при температуре окружающей среды в среднем -35,6 ⁰С и наличии различных предрасполагающих факторов во всех случаях (алкогольное опьянение средней и тяжелой степени, увлажнение поверхности тела, физическое утомление) в слизистой оболочке желудка отмечаются некротические изменения клеток и отсутствие пролиферативных процессов.

В условиях «медленного» темпа переохлаждения при температуре окружающей среды от –23 ⁰С до +10 ⁰С и наличии только в 80% случаев предрасполагающих факторов (алкогольное опьянение легкой и средней степени) наблюдается слабовыраженные некротические изменения клеток и активация пролиферативных процессов в эпителии слизистой оболочки желудка. Интенсивность пролиферации клеток при «медленном» темпе переохлаждения превышает этот показатель в нормальной слизистой оболочке желудка и в условиях быстро развивающего переохлаждения организма в 2 раза.

При статистическом анализе показателей средневзвешенной плоидности клеток полученные результаты свидетельствуют о достоверном статистическом различии исследуемых групп ( р < 0,001).

Таким образом, впервые проведенное плоидометрическое исследование эпителия слизистой оболочки желудка при смерти от гипотермии выявило особенности изменения содержания генетического материала в изучаемых клетках, которые отражают различия в темпе физиологической регенерации в агональном периоде. Проведенное исследование выявило также связь между силой и продолжительностью действия холодового фактора и ускорением темпа пролиферации клеток  слизистой оболочки желудка.

Усиление пролиферативной активности клеток слизистой оболочки желудка могут быть использованы в качестве дополнительного диагностического критерия для оценки темпа переохлаждения организма при проведении судебно-медицинских экспертиз.