Возможности иммуно-гистохимического исследований при определении давности образования двухмоментных разрывов селезенки

Работы, посвящен­ные вопросам травмы и процессам репарации при повреждениях селезенки, немногочисленны (Соседко Ю.И. 2001; Савченко С.В. и соавт., 2003). Экспертная оценка патоморфологических изменений, с целью решения вопроса давности  образования травмы селезенки, осложняется особенностями функционирования органа, в котором в физиологических условиях происходит процесс разрушения форменных элементов крови.

Нами был проведен анализ патоморфологических изменений селезенки при судебно-медицинской оценке 27 случаев экспертизы живых лиц в связи с закрытой тупой травмой живота. В работе использовался комплексный подход, который предполагал проведение расширенного варианта исследования. Для оценки особенностей патоморфологических изменений использовалось  окрашивание парафиновых срезов квасцовым гематоксилином Эрлиха – эозином, по ван Гизон и Перлсу. Кроме гистологических методов исследования, использовались иммуно-гистохимические методики.

Анализ патоморфологических изменений в зоне повреждения показал, что большая роль в развитие иммунного воспаления в связи с повреждением ткани селезенки принадлежит лимфоцитам. Как известно, клеточная иммунологическая реакция состоит из трех фаз. В первую фазу, которая наблюдается обычно во второй половине первых суток после образования повреждения, возникает активная миграция и контакт лимфоцитов с «зоной повреждения». Это сопровождается первичной сенсибилизацией Т-лимфоцитов. Далее происходит активная  пролиферация и бластная трансформация Т-зависимых клеток лимфоидной ткани, которые, как известно, обладают не только высокой клеточной активностью за счет лизосомальных ферментов. Затем происходит активация сенсибилизированных Т-лимфоцитов–киллеров. При альтерации, так же возникает гуморальная иммунная реакция, которая состоит в передачи лимфоцитами информации об антигене тимусу и затем  В-лимфоцитам. Таким образом, в реакции иммуногенеза при повреждениях органов и тканей, кроме Т-лимфоцитов,  активно участвуют и В-лимфоциты, в которых происходит гиперплазия  гранулярной эндоплазматической сети, после чего они становятся более активными и способными продуцировать антитела.

Рассматривая структуру селезенки, следует отметить, что  в периферической лимфоидной ткани лимфоциты имеют свои зоны распределения:  так называемую В-зависимую зону в периферической зоне фолликулов селезенки и Т-зависимую зону в париартериальных участках фолликулов селезенки.

При микроскопическом исследовании в зоне повреждения селезенки с целью проведения оценки полиморфноклеточной реакции, нами было выявлено большое количество лимфоцитов, поэтому нам представилось целесообразным провести морфологический анализ клеточных форм лимфоцитов, используя иммуногистохимические методики.

Иммуногистохимия получила в последние десятилетие достаточно быстрое развитие в связи с активным использованием иммунодиагностики при различных опухолевых процессах (Цыплаков Д.Э., Петров С.В., 1997). Дифференцирование с помощью иммуногистохимических методов Т и В-лимфоцитов возможно в связи с тем, что они экспрессируют различные антигены. Дело в том, что дифференциировочные антигены, т.е. антигены, которые позволяют дифференцировать различные виды лимфоцитов, достаточны специфично проявляют себя на всех этапах развития конкретной клетки (будь то В- или Т-лимфоцит).

В настоящее время появились возможности даже дифференцировать  разновидности Т-лимфоцитов, например, Т-хелперов, Т- киллеров или Т-супрессроов. Возможность проведения подобного дифференциального морфологического анализа с использованием иммуногистохимических методов появилась с момента открытия моноклонов.  До появления техники моноклональных антител большинство иммуногистохимических реакций осуществлялось  с использованием поликлональных сывороток при проведении иммунизации животных очищенным антигеном, однако полученные  в результате этого антитела имели большое количество недостатков, и прежде всего, наличие в поликлональной сыворотке антител против других антигенных детерминантов (Цыплаков Д.Э., Петров С.В., 1998).

Техника получения моноклональных антител была разработана (G.Kohler, C.Milstein, 1975)  путем производства антител гибридомой за счет слияния иммунных  (сенсибилизированных) В-лимфоцитов селезенки  мыши с линией миеломных клеток животных того же вида. За счет этого возникшая гибридома получает свойства миеломы пролиферировать до бесконечности, а во-вторых способность В-клеток продуцировать антитела, которые естественно имеют специфичность строго определенного антигена.  В результате проведения большого количества исследований возникла необходимость стандартизации и разработки общих критериев, поэтому на четырех международных конгрессах  (Paris, 1982; Boston, 1984; Oxford, 1986; Vienna, 1989) была разработана и предложена CD-классификация для  лейкоцитарных антигенов. Согласно данным этой разработанной классификации были представлены группы антител, которые реагируют с конкретными дифференциировочными антигенами.

В своей работе для проведения дифференцировки лимфоцитов мы использовали  лейкоцитарные антигены, позволяющие выявлять Т-клетки (СD3), Т-хелперы (СD4), и В–лимфоциты (с использованием СD20).  СD3 представляет собой Т-клеточный цитоплазматический маркер, позволяющий выявлять Т-лимфоциты, он выпускается в виде поликлональных антител против СD3 комплекса, включающего полипептидные цепи, связанные друг с другом и рецепторами Т-клеток. Маркер СD3 экспрессируется на 60-80% мононкулеаров циркулирующей крови, 20-40% клеток селезенки и 70% всех Т-лимфоцитов. Для удобства использования в работе с целью получения более качественных реакций при заливке в парафин применяется фиксатор Боуэна.  Клеточные цитоплазматический маркер СD4 позволяет выявлять Т-хелперы, он представляет собой поверхностный гликопротеид с молекулярной массой 59кДа, экспрессия с использованием СD4 происходит не только на поверхности клеток, но и интрацеллюлярно. Особенно в моноцитах и макрофагах. Моноклональные тела против СD4 позволяют  выявлять хелперно-индукторную субпопуляцию Т-лимфоцитов (Цыплаков Д.Э., Петров С.В., 1998).) Антитела против СD4 эффективно выявляются при использовании парафиновых срезов. Для выявлении субпопуляции В-лимфоцитов мы использовали негликолизированный фосфолипопротеид СD20, это цитоплазматический антиген большинства нормальных В-лимфоцитов, экспрессируется в фолликулах , реже в мякотных тяжах и еще реже в синусах и паракортикальной зоне  лимфатических узлов. СD20 кроме В-лимфоцитов может также дифференцировать дендритные ретикулярные клетки использование в работе иммуногистохимических методик, позволяющих выявлять лейкоцитарные антигены, дает возможность подходить к вопросам оценки поликлеточной реакции в области повреждений селезенки более дифференцированно. Для исследования использовались стандартные парафиновые блоки. Проведение расширенного микроскопического исследования, включающего иммуногистохимические методики,  позволило более полно судить о динамике развития воспалительной реакции в зоне повреждения. При исследовании селезенки следует учитывать особенности патоморфологических изменений,  как непосредственно в зоне повреждения, сопровождающегося кровоизлиянием, так и в перифокальной (пограничной). При морфологической оценке необходимо помнить о различиях клеточного состава в белой и в красной пульпе. Использование в работе иммуногистохимических методик, позволяющих выявлять лейкоцитарные антигены, дает возможность подходить к вопросам оценки полиморфноклеточной реакции в области повреждений селезенки более дифференцированно. Использования указанных методов морфологического исследования дает возможность получить более объективную и полную информацию для определения давности образования повреждения селезенки.