Роль методов АЭС-ИСП, ИСП-МС И ГРС в оценке нарушения металло-лигандного гомеостаза

Процессы апоптоза, регенерации, митоза, выживаемости клеток связаны с внутриклеточными превращениями микроэлементов (МЭ). Поддержание стабильного уровня внутриклеточных МЭ является необходимым условием сохранения металло-лигандного гомеостаза (МЛГ). Дисбаланс МЭ может быть следствием введения токсикантов любой природы - применения ряда лекарственных препаратов, употребления наркотиков, алкоголя, неполноценного питания, социально-экономического неблагополучия, а также природных условий геобиопровинций, в почвах и водах которых очень низкое или очень высокое содержание тех или иных МЭ. Изучение молекулярно-генетических функций МЭ в организме и их клинических проявлений стало возможным при мультидисциплинарном подходе к решению проблемы и при использовании как многоэлементных методов (ИСП-АЭС и ИСП-МС) системного анализа МЭ в биообъектах, так и прямого метода определения электронного состояния металлов - гамма-резонансной спектроскопии (ГРС), что дало возможность рассматривать роль МЭ в структуре комплекса в зависимости от ближайшего лигандного окружения, определять, в какой форме /ионогенной или ковалентной/ и степени окисления находятся МЭ [5,6]. Интенсивность и особенности реагирования организма на дисбаланс МЭ или лигандов /L/ индивидуальны и связаны с генетическими механизмами МЛГ. Основная проблема в настоящее время заключается в выборе алгоритмов правильной интерпретации результатов количественного определения МЭ с учетом их соотношений, содержания клинически важных биолигандов /биомаркеров, или молекулярных индикаторов дисбаланса МЭ/, определения ионогенной или координированной формы нахождения МЭ. Обмен, циркуляция, депонирование ионов металлов объясняются их способностью участвовать в процессах комплексообразования с природными эндогенными лигандами /нуклеиновыми кислотами, углеводами, аминокислотами, пептидами, белками, витаминами, гормонами/ и экзогенными лигандами /токсикантами, лекарственными препаратами, пищевыми продуктами и др./. Организм - сложная динамическая полилигандная и полиметаллическая система, для функционирования которой необходимо поддержание МЛГ. Исследования в области биохимии и молекулярной медицины свидетельствуют о значительных изменениях в обмене и балансе МЭ на клеточном, тканевом, организменном уровнях при патологических процессах [1,6].

Более 80% употребляемых лекарственных препаратов (в том числе и наркотиков), продуктов питания могут вступать в реакции комплексообразования с металлами in vivo, вызывая нарушение баланса МЭ клетки и ятрогенные микроэлементозы. С другой стороны, микроэлементный состав биожидкостей и тканей отражает суммарное содержание МЭ, включая их поступление из среды обитания, что позволяет использовать количественные значения уровней микроэлементов в клинико- токсикологической диагностике и судебно-химическом анализе в практике судебно- медицинской экспертизы техногенных катастроф.

Оценка элементного статуса человека является основным вопросом определения влияния на здоровье человека дефицита, избытка или нарушения тканевого перераспределения макро- и микроэлементов. Главной задачей всегда является выбор наиболее подходящих для целей исследования биомаркеров и методов анализа. Например. Исследование волос представляет интерес для выявления состояния обмена микроэлементов в организме и токсического воздействия отдельных металлов. Имеющиеся данные по оценке преимуществ и недостатков элементного анализа волос показывают, что содержание микроэлементов в волосах отражает микроэлементный статус организма в целом. Пробы волос являются интегральным показателем минерального обмена, а также архивным материалом в историческом биомониторинге, что, при постоянном совершенствовании аналитической базы, открывает новые возможности для этого вида контроля уровня элементов в человеческом организме при проведении судебно-медицинской экспертизы, а также оценки влияния других (множественных) факторов. Изменение содержания МЭ - кратковременное по экспозиции и значительное по степени отклонения элементного статуса - отражается в концентрации МЭ в жидких средах организма, которые являются информативными биосредами, как для целей клинико- токсикологического, так и судебно- химического анализа.

Нами разработаны методические подходы к биотестированию, базирующиеся на установленных корреляционных связях между содержанием МЭ, их соотношением, ионогенной или координационно-связанной формой нахождения в биообъектах и интенсивностью протекающих в организме процессов образования активных форм кислорода, кинетикой свободнорадикального окисления.

Аналитические исследования биообъктов /кровь, моча, слюна, волосы, ногти и др./ выполнены согласно требованиям МАГАТЭ и методических рекомендаций ФЦГСЭН РФ в лабораториях ИХФ РАН, МГУ и АНО "Центр Биотической Медицины" методами АЭС-ИСП, ИСП-МС, ГРС, РФА и др.

Задача определения малых концентраций химических элементов в различных биообъектах требует применения высокочувствительных инструментальных методов анализа и стандартных образцов сравнения для адекватной оценки полученных результатов. Основные требования, предъявляемые к методам, - сочетание низких пределов обнаружения, высокой чувствительности и селективности [7].

В настоящее время для определения элементов в биообразцах большое распространение получили методы атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (АЭС-ИСП) и масс-спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой (ИСП-МС), которые позволяют вместе и по отдельности одновременно определить в одной пробе 60 и более макро-, микро- и ультрамикроэлементов, что очень важно при оценке взаимодействия и взаимовлияния одних элементов с другими в организме человека. Для определения элементов в биосубстратах нами разработан новый подход с использованием комплекса двух методов: ИСП-АЭС и ИСП-МС. Высокая точность и воспроизводимость результатов, умеренная чувствительность, ограничивающая реальный круг определяемых элементов, и более низкая себестоимость характерны для ИСП-АЭС метода, в то время как исключительная чувствительность и больший набор определяемых элементов — преимущества ИСП-МС. Применение ИСП-МС позволило приблизиться и к решению задачи анализа больших партий разнородных образцов на большинство элементов с пределами обнаружения и диапазоном определяемых концентраций адекватными распространенности элементов в большинстве биомедицинских и экологических объектов. Надежность современного оборудования, простота и точность калибровки по общедоступным стандартным образцам, относительная свобода от взаимных физических и химических влияний при анализе - несомненные достоинства метода ИСП-МС.

Следует отметить, что высокая стоимость подобных приборов пока тормозит широкое внедрение методов ИСП-АЭС и ИСП-МС в практическую деятельность в нашей стране. Однако в европейских странах и США эти методы широко используются в клинической и судебной токсикологии.

Нам как членам Федерации Европейских Обществ по изучению микроэлементов и Института микроэлементов ЮНЕСКО было поручено проведение клинико-токсикологического исследования элементного состава волос 69 детей, проживающих на территории Республики Македония /группа 1, основная (59 человек) – г. Велес и группа 2, контрольная (10 человек) – с. Иванковцы/.

Все образцы волос подвергались пробоподготовке согласно[2] (МУК 4.1.1482-03, МУК 4.1.1483-03 «Определение химических элементов в биологических средах и препаратах методами атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой и масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой», утвержденным Минздравом РФ в 2003 г.). Аналитические исследования выполнены в испытательной лаборатории АНО «Центр Биотической Медицины», аккредитованной при ФЦ ГСЭН (аттестат аккредитации ГСЭН.RU.ЦОА.311, регистрационный номер в Государственном реестре РОСС RU.0001.513118 от 29 мая 2003) методом атомной эмиссионной спектрометрии и масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой (АЭС-ИСП, МС-ИСП). Статистическая обработка полученных данных проводилась при помощи программ Microsoft Excel 2003 и Statistica6.0

Для расчета частоты значений, выходящих за границы условной нормы использовались значения условного биологически допустимого уровня (УБДУ) содержания химических элементов в волосах, используемые в АНО ЦБМ [3,4]. Согласно данным, представленным в таблице 1, в ходе проведения работы установлены достоверные различия между содержанием химических элементов в волосах детей из г. Велес (группа 1) и с. Иванковцы (группа 2). В первую очередь, следует отметить высокое содержание Pb в волосах детей в группе 1 (5,62±0,84 мкг/г волос), что в 3,8 раза выше, чем в группе 2. Аналогичные результаты дает анализ содержания Ni, As и Cd в волосах детей: концентрация этих токсичных элементов в волосах у детей из 1 группы достоверно выше по отношению к контролю.

На уровне тенденций (p < 0,1), дети из группы 1 по сравнению с группой 2 отличаются также повышенным содержанием Hg (в 3,5 раза), Sn (1,8 раза), Se (1,6 раза), Na (1,7 раза) и Cu (1,2 раза) на фоне относительно сниженного содержания в волосах таких эссенциальных химических элементов, как Cr (1,5 раза), Mg (1,4 раза), Mn (1,6 раза) и Li (1,7 раза).

В таблице 2 представлены частоты отклонения содержания химических элементов в волосах детей из групп 1 и 2 от границ УБДУ. Рассчитанные таким образом частоты отклонений хорошо согласуются с приведенными выше результатами анализа абсолютных данных (табл. 1). Повышенный уровень в волосах Pb (выше 5 мкг/г волос) наблюдается у 42,5% обследованных детей из г. Велес (группа 1) и не обнаружен ни у одного ребенка из группы 2 (с. Иванковцы). Повышенное содержание в волосах Ni обнаружено у 13,8%, Cu – у 16%, Cd – у 21% детей из г. Велес и, как и в случае со свинцом, не обнаружено у детей из г. Иванковцы.

Помимо высокой частоты значительных концентраций токсичных химических элементов для детей из г. Велес характерны сниженные концентрации эссенциальных химических элементов. Так, сниженное содержание Mg в волосах обнаружено у 51%, Mn – у 46%, Fe – у19%, P – у 46% и Zn – у 38% обследованных детей, в то время как аналогичные показатели во 2 группе (Иванковцы) составили 0% (Mg), 20% (Mn), 10% (Fe), 0% (P) и 20% (Zn).

В волосах детей, проживающих в зоне влияния свинцово-цинкового комбината г. Велес, достоверно повышена концентрация Pb, Hg, Ni, Cd, Sn, As, Na, Se и понижена концентрация Mg, Mn, Cr и Li по отношению к контрольной группе.

Таким образом, выявлены характерные особенности элементного профиля волос детей, проживающих в г. Велес, причем эти особенности обусловлены воздействием на окружающую среду свинцово-цинкового комбината, и могут служить своеобразной «визитной карточкой» обследованной местности. Элементный профиль волос детей отражает экологические особенности обследованной территории. Анализ волос является одним из наиболее пригодных для целей массовых, скрининговых исследований состояния элементного баланса на популяционном и индивидуальном уровнях.

Однако всегда следует помнить, что абсолютные величины содержания МЭ не могут и не должны интерпретироваться вне концепции МЛГ. В природе распространены координированные влияния нескольких микроэлементов: существуют пары( Fe/Mn, Fe/Zn, Zn/Cu, Cd/Cu, Cu/Mo и др.) и триады микроэлементов (I ₂, Ca, PO₃ ^3-); (Mo, Cu, SO₄ ^2- и др.), которые оказывают синергические или антагонистические влияния на различные физиологические и патологические показатели. Например: низкий уровень Se в сыворотке крови указывает на снижение антиоксидантной защиты организма, что, в свою очередь, способствует большим повреждениям тканей печени и миокарда. Антагонистами Se являются Pb, Hg, Cd, As. Имеются данные о механизме повреждающего действия этих элементов, который основан на различии величин констант образования их комплексов с серусодержащими аминокислотами по сравнению с производными селена. Поэтому весьма важно получить информацию о количественном содержании как можно большего числа микроэлементов в одной пробе одновременно и в различных типах биообъектов (например, в крови и волосах). В обсуждаемом исследовании низкий уровень Se в сыворотке крови и повышенная его концентрация в волосах в совокупности с результатами многоэлементного анализа металлов и количественного определения клинически важных молекулярных индикаторов дисбаланса МЭ, определения ионогенной или координированной формы их нахождения свидетельствует о токсическом действии Pb, Hg, Cd, As, Ni, , Sn.

Что такое норма в биологических пробах? Например: концентрация Zn в волосах падает в течение первых 3-х лет жизни ребенка; Cr и Si в некоторых тканях снижается на протяжении всей жизни. Анормальная концентрация одного элемента, не имеющего самостоятельного токсического эффекта, может явиться указанием на анормальные концентрации других МЭ, содержание которых не собирались определять в ходе данного исследования, однако дисбаланс именно этих МЭ может быть причиной той или иной патологии.

Выявлено существенное влияние огнестрельного ранения на элементный статус человека, установлен ряд особенностей в соотношении МЭ в крови и волосах раненых, характерных для различных периодов времени после ранения. Установлено, что высокий уровень антропогенной нагрузки на систему «мать - плод» приводит к дисбалансу микроэлементов в биосредах фетоплацентарного комплекса. На основании результатов анализа содержания МЭ в почве и питьевой воде на территории районов с различной степенью антропогенного загрязнения и уровня накопления МЭ в плаценте и крови плода были выявлены приоритетные территориальные экотоксиканты биосред фетоплацентарного комплекса. Полученные данные могут быть полезны при интерпретации результатов проведения определенных СМЭ.

Согласно международным стандартам при анализе методами ИСП-АЭС и ИСП-МС каждый элемент должен подчиняться линейной зависимости (от 0 до 25 или 250 нг/мл или нг/мг, что связано с природой металла и типом биообъекта) с коэффициентом корреляции не менее 0.99. Внутри и межлабораторные ошибки должны быть не более 5% и 10% соответственно. Наша лаборатория является зарегистрированным участником межлабораторной международной программы (совместное участие в выполнении научных исследований по грантам ЕС) сравнения методов анализа цельной крови, плазмы, мочи и волос с головы людей, с избытком тех или иных элементов, не связанным с профессиональной деятельностью. Предел количественного обнаружения варьирует от 0.002 нг/мл (U) до 8.1 нг/мл (Al) для цельной крови, от 0.002 нг/мл (U) до 7.7 нг/мл (Al) для плазмы, от 0.001 нг/мл (U) до 2.2 нг/мл (Se) для мочи, и от 0.2 нг/мг (Tl) до 0.5 нг/мг (B) для волос. Референтные значения определены у здоровых добровольцев, объем выборки приближается к 10000.

Резюме

Токсический эффект многих лекарственных препаратов является результатом их взаимодействия in vivo с микроэлементами, приводящего к нарушению баланса микроэлементов в организме. Мессбауэровская спектрометрия была использована для токсикохимической оценки железосодержащих лекарственных препаратов. Метод предлагается применять для целей судебной токсикологии.

Проведено изучение элементного состава волос детей, проживающих в гг. Велес (зона загрязнения) и Иванковцы (контроль) (Македония), методами АЭС-ИСП и МС-ИСП. Установлено достоверно повышенное по сравнению с контролем содержание в волосах у детей из г. Велес Pb, Hg, Ni, Cd, Sn, As, Na, Se и пониженное – Mg, Mn, Cr и Li. Для детей из г. Велес характерно повышенное содержание в волосах Pb (43% детей), Cd (21%), Cu (16%), Ni (14%) и пониженное содержание Mg (51% детей).

Таблица 1

Содержание химических элементов в волосах детей, проживающих в зоне влияния свинцово-цинкового комбината в сравнении с контрольной группой (мкг/г волос).

• жирный шрифт – достоверное отличие между г. Велес и с. Иванковцы
•                      — достоверное отличие по сравнению с Москвой и Российской Федерацией (Р < 0,05)

Таблица 2.

Частоты отклонений в содержании химических элементов в волосах детей г. Велес и с. Иванковцы от границ УБДУ (%).