Разработка методологии диагностики давности криминального захоронения трупа хроматографическим методом

Проблема диагностики давности захоронения трупов, в частности при криминальных захоронениях, продолжает оставаться одной из важнейших задач судебной медицины. Анализ литературы показывает, что для объективной оценки давности захоронений, при сроках от 3 суток до года отсутствуют не только конкретные методики, но и методологические подходы к решению данной задачи [1, 2].

Нами разработан новый методологический подход к оценке давности захоронения трупа в почве путем хроматографического анализа продуктов аутолиза тканей.

Наиболее характерные типы почв края – выщелоченный малогумусный мощный чернозем (район г. Краснодара), карбонатный малогумусный сверхмощный чернозем (район г. Армавира, Тихорецка и др.), дерново-карбонатная почва (район Черноморского побережья). С учетом количества производивших эксгумаций нами выбраны два типа почв. В ящики с почвой из окрестностей гг. Краснодара и Новороссийска была помещена мышечная ткань. Интервалом 24 часа, 72 часа, 7 суток, 14 суток, 30 суток, 2 месяца, 6 месяцев изымалась для гистологического исследования.

Определенной зависимости морфологических изменений от сроков захоронения не наблюдалось, что свидетельствует о необходимости поиска методов, позволяющих устанавливать давность захоронения при гнилостной трансформации трупа. По нашему мнению, определенное место в решении этой проблемы могут занять методы хроматографического исследования кислотнорастворимой фракции мышечной ткани, которая является более устойчивой к гнилостным процессам.

Методика хроматографического исследования разрабатывалась нами на основе работы Н.А. Тумановой, в которой приведены условия выделения кислотнорастворимой фракции (КРФ) мышечной ткани трупа и ее хроматографического анализа [3]. Пробоподготовка образцов заключалась в замораживании 2 г ткани в жидком азоте, растирании ее в ступке и последовательном настаивании с 0,6 н и 0,3 н растворами хлорной кислоты. Анализ КРФ проводился методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в изократическом режиме на колонке диаметром 4,6 мм и длиной 250 мм с сорбентом Zorbax C8. Элюент - 0,02 М раствор дигидрофосфата аммония. Детектирование фотометрическое при 254 нм.

Использованный нами современный отечественный прибор «Милихром А02», позволяет применять микроколоночную технику эксперимента, что существенно повышает чувствительность анализа при десятикратной экономии элюента. Спектрофотометрический детектор имеет диапазон длин волн от 190 до 360 нм. Наши эксперименты показали, что при незначительных гнилостных изменениях ткани компоненты кислотнорастворимой фракции (ККРФ) успешно разделяются в указанных условиях, но чувствительность детектирования не всегда удовлетворительна. Было установлено, что снижение длины волны до 220 нм позволяет в несколько раз повысить чувствительность обнаружения большинства ККРФ (Рис.1). При существенном гнилостном изменении мышечной ткани обнаружен недостаток изократического режима. Часть ККРФ, обладающая недостаточно высокой полярностью длительное время удерживается в колонке, и не выходит из нее за время анализа, что приводит к потере информации о составе пробы. При последующих анализах эти вещества обнаруживаются в виде широких пиков, искажающих результаты.

Экспериментальным путем по результатам хроматографирования КРФ образцов с разной степенью аутолиза подобраны оптимальные условия анализа. Колонка диаметром 2 и длиной 75 мм с сорбентом Silasorb SPH C18 (размер частиц 5 мкм), элюент – смесь 0,02 М раствора фосфата аммония и метанола, состав элюента программируется от 10 до 80 % метанола за 9 мин, расход элюента – 200 мкл/мин. Детектирование при 220 нм. (Рис.2).

Типичная хроматограмма приведена на рис. 2. Из многочисленных пиков ККРФ нами были выбраны наиболее характерные, присутствующие на хроматограммах проб мышц с разной степенью гнилостного разложения. Пики имеют время удерживания 3,7; 4,1; 4,6; 5,0; 6,0 мин. Величины времен удерживания колебались в пределах 2 - 5%, что является достаточной воспроизводимостью для сравнительного анализа хроматограмм. Точная идентификация, т.е. определение химической природы обнаруживаемых ККРФ является весьма сложной задачей и выходит за рамки настоящего исследования. Нами установлено, что площади рассматриваемых пиков, пропорциональные концентрациям ККПФ изменяются в зависимости от степени аутолиза образца и могут быть показателем, характеризующим время нахождения мышечной ткани в почве.

Наши исследования показали, что оценка давности длительного (свыше 1 месяца) криминального захоронения на базе исследования состояния морфологии органов, по нашему мнению, невозможна.

Хроматографическое исследование компонентов кислоторастворимой фракции мышечной ткани является перспективным методом оценки степени аутолиза ткани, а, следовательно, и сроков давности криминального захоронения.

Рис. 1. Хроматограмма кислоторастворимой фракции мышечной ткани в изократическом режиме. Элюент - 0,02 М раствор дигидрофосфата аммония. Детектирование при 254 нм (сплошная линия) и при 220 нм (пунктирная линия).

Рис. 2. Хроматограмма кислоторастворимой фракции мышечной ткани в градиентном режиме. Элюент – смесь 0,02 М раствор дигидрофосфата аммония и метанола. Концентрация метанола возрастает от 10 до 80% за 9 мин. Детектирование при 254 нм (сплошная линия) и при 220 нм (пунктирная линия).