Изолирование, обнаружение и определение фторурацила в трупном материале

Фторурацил (2,4-диоксо-5-фторпиримидин) используется в медицине в качестве химиотерапевтического средства для лечения злокачественных новообразований. Он обладает высокой токсичностью, относится к списку А. Суточная доза фторурацила не должна превышать 1 г. общая доза на курс лечения 3—5 г (2).

В судебно-медицинской практике отмечены случаи отравлений этим препаратом с летальным исходом. Методика судебно-химического доказательства фторурацила в трупном материале не разработана.

Целью настоящего исследования явилась разработка методики изолирования обнаружения и судебно-химического определения фторурацила в трупном материале.

Экспериментальная часть. Исследование проводили на модельных смесях фторурацила. удовлетворяющего требованиям ФС 42—1085—77. с почками трупов людей, погибших вследствие травмы. Выбор почки основан на том, что фторурацил при приеме внутрь в максимальных количествах депонируется в этом органе |1].

На 1-м этапе работы нами было изучено влияние различных факторов на экстракцию фторурацила из водных растворов. Было установлено, что pH среды, время экстрагирования и наличие электролитов практически не влияют на экстракцию фторурацила. Существенное влияние оказывают природа органического растворителя и кратность экстракции. Выявлено, что лучшим экстрагентом для фторурацила является смесь этилацетата с н-пропанолом в соотношении 70: 30. Полнота извлечения достигается четырехкратным экстрагированием. При содержании 0,100—1,000 мг фторурацила в оптимальных условиях в среднем экстрагируется 99,4—94,9% соответственно. Гексан, хлороформ, бензол практически не извлекают фторурацил и могут быть использованы для экстракционной очистки извлечений из биологического материала от балластных веществ.

Для изолирования фторурацила из биологического материала нами были изучены общепринятые в судебно-химическом анализе для алкалоидов и синтетических азотсодержащих лекарственных соединений методы извлечения подкисленной водой (метод Васильевой) и подкисленным спиртом (метод Стаса - Отто) [3]. Результаты исследования приведены в табл. I.

Опыты показали, что метод извлечения подкисленной водой является неэффективным для изолирования фторурацила. поскольку в среднем этим методом извлекается 10,8% от добавленных 10 мг препарата. Больший возврат добавленного фторурацила позволяет получить метод изолирования подкисленным спиртом (25,7%). Однако этот метод трудоемок и требует значительной затраты времени.

Исходя из сходства химического строения фторурацила и производных барбитуровой кислоты, нами был изучен вольфраматный метод, который рекомендован для изолирования производных барбитуровой кислоты и других кислых и нейтральных лекарственных средств [4].

Таблица 1

Изолирование фторурацила из почек различными методами исследования (n=5)

Установлено, что вольфраматный метод является лучшим для изолирования фторурацила из изученных методов (см. табл. 1). Этим методом при содержании в 100 г почек 10 мг препарата в среднем извлекается 39,6% его по сравнению с 10,8 % и 25,7 % при изолировании методами Васильевой и Стаса — Отто. Кроме того, достоинствами вольфрамового метода являются его экспрессность и возможность получения менее загрязненных балластными веществами извлечений. Это позволяет использовать большую аликвоту извлечения для нанесения на хроматографическую пластинку без перегрузки тонкого слоя сорбента.

Для обнаружения фторурацила в извлечении применены хроматография в тонком слое сорбента (на пластинках «Силуфол») и спектрофотометрия. Фторурацил не образует осадков или окрашивания с общеалкалоидными реактивами. Количественное определение препарата проводили спектро-фотометрическим методом. Он имеет в водных и спиртовых нейтральных и кислых растворах один максимум абсорбции при 266 нм. В щелочных растворах происходит батохромный сдвиг максимума абсорбции до 296 нм. Удельный показатель поглощения (E^1%1см) при 226 нм равен 550.

В результате проведенных исследований нами разработана методика изолирования, обнаружения и количественного определения фторурацила в биологическом материале.

Методика. 50 г измельченной ткани почки гомогенизировали в смесителе с 50 мл 25% раствора вольфрамата натрия и 50 мл дистиллированной воды. Гомогенизат переносили в колбу вместимостью 1 л и смеситель промывали 200 мл воды, которую присоединяли к гомогенизированной ткани. К смеси добавляли 50 мл 50 % раствора бисульфата натрия, перемешивали и нагревали на водяной бане до коагуляции белков и потемнения жидкости. Затем горячую смесь фильтровали через двойной бумажный фильтр под вакуумом. После охлаждения фильтрата до комнатной температуры производили экстракционную очистку извлечения последовательно равными объемами хлороформа, бензола, гексана. Органические фазы отбрасывали, а к водной фазе добавляли равный объем смеси этилацетат — н-пропанол (70: 30) и экстрагировали в течение 2 мин. Органическую фазу отделяли. а из водной фазы еще трижды экстрагировали фторурацил в этих же условиях. Органические фазы объединяли и фильтровали через безводный сульфат натрия. Растворитель отгоняли на ротационном испарителе или выпаривали в фарфоровой чашке на водяной бане при температуре до 80 °С досуха. Остаток обрабатывали порциями 50 мл 96% этанола, фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводили объем спиртом до метки. В полученном спиртовом растворе производили качественное обнаружение и количественное определение фторурацила. Аликвоты извлечения (0,5—2,5 мл) переносили в виде пятен на линию старта 4 хроматографических пластинок марки «Силуфол УФ-254». В качестве метчика наносили спиртовой раствор фторурацила (20 мкг). Растворитель удаляли и пластинки хроматографировали в системах: этилацетат (R_f=0,38), бензол — ацетон 4:5 (R_f = 0,43), этилацетат ацетон 7:3 (R_f=0,64), бензол — этилацетат — ацетон 2:5:3 (R_f = 0,48). Пробег фронта растворителя составил 10 см. Пластинки вынимали из камер, высушивали при комнатной температуре до удаления растворителей и просматривали в ультрахемископе при длине волны 254 нм. В извлечении наблюдали темно-фиолетовые пятна на уровне метчика. Затем пластинки опрыскивали 0,02 % раствором дифенилкарбазона в хлороформе и 5 % раствором сульфата ртути. В извлечении на уровне метчика наблюдали сине-фиолетовые пятна препарата. При низких концентрациях препарата (слабое окрашивание в УФ-свете) после опрыскивания пластинок растворами дифенилкарбазона и сульфата ртути пятна фторурацила в извлечении могут не наблюдаться, так как чувствительность этого метода детектирования препарата на пластинках в 6 раз ниже по сравнению с методом детектирования в УФ-свете. Далее в одной аликвоте извлечения проводили спектрофотометрическое обнаружение фторурацила и его количественное определение. 5 мл извлечения упаривали до объема 0, 5 мл и количественно наносили на линию старта хроматографической пластинки «Силуфол УФ-254» в виде полосы длиной 8—10 см. На расстоянии 2 см от полосы в виде пятна наносили метчик (спиртовой раствор фторурацила). Хроматограмму развивали в этилацетате. Пробег фронта растворителя составил 10 см. Пластинку вынимали из камеры и высушивали на воздухе до удаления растворителя. Затем пластинку просматривали в УФ-свете при 254 нм. На уровне пятна метчика отмечали темно-фиолетовую зону, соответствующую расположению фторурацила на пластинке. Границу зоны очерчивали острием иглы и вырезали с пластинки ножницами. Силикагель с вырезанной зоны снимали с помощью скальпеля и переносили в небольшой цилиндр с притертой пробкой. Элюирование фторурацила с силикагеля проводили 15—25 мл (в зависимости от количества препарата) 96% этанола в течение 3 ч при периодическом перемешивании Элюат фильтровали через небольшой бумажный фильтр и доводили спиртом до определенного объема. Снимали спектральную характеристику в УФ-области в диапазоне 200— 320 нм. В качестве раствора сравнения использовали этанол. При наличии фторурацила наблюдали один максимум абсорбции при 266 нм. Отмечали оптическую плотность раствора при этой длине волны, величину которой использовали для расчета количественного содержания фторурацила. Затем в кювету добавляли 1 каплю 5 % спиртового раствора гидроксида натрия. При этом наблюдали батохромный сдвиг максимума абсорбции до 296 нм. Количественное содержание фторурацила рассчитывали с использованием удельного показателя поглощения при 266 нм.

Сочетание методов хроматографии в тонком слое сорбента и спектрофотометрии в УФ-области позволяли дифференцировать фторурацил от производных барбитуровой кислоты и других лекарственных азотсодержащих соединений, которые отличаются от фторурацила по величинам R_f, спектральным характеристикам и отношением к общеалкалоидным реактивам.

При исследовании контрольных проб почек результаты качественного обнаружения во всех случаях были отрицательными. При количественном определении фон контрольных проб составлял до 0,05.

В табл. 2 приведены результаты количественного определения различных количеств фторурацила в почках трупа человека разработанным нами методом.

Как видно из табл. 2, разработанный метод позволяет определять фторурацил в трупном материале с достаточной точностью. При содержании от 1,00 до 10, 00 мг фторурацила в 50 г почек в среднем определяется от 38 до 40, 4 % его со стандартным отклонением 7—3 % соответственно.

Граница обнаружения фторурацила предложенным методом составляет 0, 3 мг в 50 г органа, граница определения — 0,75 мг в 50 г органа.

Разработанный метод применим к исследованию трупного материала без признаков значительного гнилостного разложения.

Таблица 2

Определение фторурацила в почках трупа человека разработанным методом (n= 5)

¹ При расчетах полученные в контрольных пробах значения фона вычитались.

Выводы

1. Разработан метод изолирования, обнаружения и количественного определения фторурацила в трупном материале. Метод включает изолирование фторурацила вольфраматным методом, экстракционную очистку извлечения от балластных веществ, экстракцию препарата смесью этилацетата с н-пропанолом, обнаружение фторурацила с использованием хроматографии в тонком слое сорбента (и спектрофотометрии), а также количественное определение фторурацила спектро-фотометрическим методом.
2. Граница обнаружения фторурацила предложенным методом составляет 0,3 мг в 50 г органа, граница определения — 0,75 мг в 50 г органа. При содержании от 1, 00 до 10, 00 мг препарата в 50 г почек этим методом в среднем определяется от 38,0 до 40, 4 % его со стандартным отклонением 7, 0—3, 0 % соответственно.
3. Обнаружению и определению фторурацила не мешают балластные вещества, производные барбитуровой кислоты и другие азотсодержащие лекарственные соединения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Агаджанова Н. Н., Смолянская А.З., Тугаринов О. А. // Вопр. онкол. — 1969. — № 2. — С. 57—61.
2. Машковский М. Д. Лекарственные средства — 8-е изд. — М„ 1977. — Ч. 2. — С. 404—405.
3. Швайкова М. Д. Токсикологическая химия. — 3-е изд. — М., 1975. — С. 120—131.
4. Clarke Е.G.С. Isolation and Identification of Drugs. — London, 1969. — P. 22-23.