Определение аймалина в биологическом материале

Аймалин (алкалоид, выделенный из некоторых видов раувольфии) применяется в медицине для лечения аритмий (3). В литературе описаны случаи отравления аймалином, он имеет определенное токсикологическое значение (4—7). Однако в судебно-химическом отношении этот препарат практически не изучен. Отсутствуют методы изолирования аймалина из объектов биологического происхождения, способы его обнаружения и количественного определения.

Ранее нами была проведена сравнительная оценка результатов изолирования аймалнна из печени трупов людей. С помощью метода, основанного на изолировании алкалоидов водой, подкисленной щавелевой кислотой, выделялось 25, 4—26, 2% аймалина, по методу В. Ф. Крамаренко —13, 3—15, 1%, по методу Стаса—Отто — 28, 3—31, 2% этого препарата. Однако последний метод имеет ряд существенных недостатков (значительная продолжительность анализа, потери вещества при осаждении примесей, расходование большого количества этанола). При изолировании по методу В. Ф. Крамаренко аймалин после добавления сульфата аммония выпадает в осадок. Учитывая отмеченные недостатки применяемых в судебно-химических отделениях некоторых методов изолирования алкалоидов, мы разработали собственную методику изолирования аймалина из биологического материала.

Экспериментальная часть. Исследования показали, что аймалин, как и другие алкалоиды, выделяемые по методу В. Ф. Крамаренко (1), хорошо изолируется из биологического материала 0, 02 н. раствором серной кислоты при pH 2, 0—2, 5. Для очистки полученных вытяжек применили метод гель-хроматографии, основанный на разделении веществ в зависимости от размера молекул и молекулярной массы. С этой целью использовали гель молселекта Г-50 (размер частиц в сухом состоянии 120—320 мкм).

Вначале изучили распределение аймалина на колонке, заполненной этим гелем. Для получения геля молселект заливали 0, 02 н. раствором серной кислоты и оставляли на 8 ч для набухания. Затем переносили его в стеклянную колонку длиной 40 см с внутренним диаметром 2, 5 см. Через колонку с гелем пропускали но 10 мл раствора аймалина (в 1 мл раствора содержался 1 мг препарата) в 0, 02 н. серной кислоте. В качестве элюирующей жидкости использовали 0, 02 н. раствор серной кислоты. Элюаты собирали фракциями по 1 мл, в каждой из которых аймалин определяли спектро-фотометрически (в УФ-области) при длине волны 245 нм (Е^1%1см=191) с помощью спектрофотометра СФ-26 (кювета 1 см). Исследования показали, что аймалин элюируется из колонки с 16-й по 35-ю фракции. Изучено также распределение на той же колонке белковых веществ и других примесей, содержащихся в вытяжках из печени трупов лиц, погибших от травм. Установлено, что основная масса примесей элюируется из колонки в 8-й — 15-й фракциях. Для количественного определения выделенного из биологического материала аймалина нами разработан фотоколориметрический метод, основанный на взаимодействии этого препарата с раствором бромтимолового синего при pH 7, 6 и на последующей экстракции образовавшегося ионного ассоциата хлороформом. Хлороформные вытяжки взбалтывали с раствором щелочи, из ионного ассоциата выделялся бромтимоловый синий, количество которого было эквивалентно количеству аймалина. Оптическую плотность раствора бромтимолового синего измеряли фотоэлектроколориметром ФЭК-56М (светофильтр №8, кювета 20 мм). Светопоглощение окрашенных растворов подчинялось закону Бугера—Ламберта-Вера в пределах концентраций от 5 до 110 мкг аймалина в пробе.

В результате проведенных исследований разработана методика изолирования аймалина из биологического материала водой, подкисленной серной кислотой до pH 2, 0—2,5 с последующей очисткой полученной вытяжки с помощью геля молселекта Г-50.

Методика изолирования аймалина. К 100 г измельченной печени трупа добавляли известные количества аймалина (от 0, 5 до 10 мг) и оставляли на сутки при частом перемешивании содержимого стаканов. По истечении указанного времени печень заливали 75 мл 0, 02 н. раствора серной кислоты и настаивали в течение часа при частом перемешивании. При изменении pH смеси доводили 20 % раствором серной кислоты до pH 2, 0—2, 5 (по универсальному индикатору). Вытяжку сливали с твердых частиц биологического материала, процеживали через марлю, а печень еще дважды настаивали с новыми порциями 0, 02 н. серной кислоты (по 75 и 50 мл), каждую в течение 1 ч. Объединенные кислые вытяжки центрифугировали в течение 30 мин при 5000 об/мин.

20 мл полученной вытяжки, содержащей аймалин, переносили в колонку с гелем и препарат элюировали 0, 02 н. раствором серной кислоты. Первые 150 мл элюата отбрасывали, а последующие 200 мл собирали и переносили в делительную воронку. Элюат подщелачивали 30 % раствором гидроксида натрия до pH 9, 0—11, 0 и трижды взбалтывали с хлороформом (по 70 мл). Затем от водной фазы отделяли слой органического растворителя, хлороформные вытяжки объединяли и хлороформ выпаривали до сухого остатка. Этот остаток смывали хлороформом и количественно переносили в мерные колбы вместимостью 25 мл. Объем жидкости в колбе доводили хлороформом до метки.

Результаты изолирования аймалина из биологического материала

Количественное определение аймалина. 5 мл полученного хлороформного раствора переносили в делительную воронку, в которую добавляли 5 мл хлороформа, 9, 8 мл фосфатного буферного раствора с рН=7, 6 (2) и 0,2 мл раствора бромтимолового синего. Смесь в воронке взбалтывали в течение 1 мин. затем от водной фазы отделяли хлороформный слой. Водную фазу вновь взбалтывали (1 мин) с 5 мл хлороформа. К объединенным хлороформным вытяжкам прибавляли 10 мл 0, 05 н. раствора гидроксида натрия и взбалтывали. Водный слой, окрашенный в синий цвет, переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и объем жидкости доводили водой до метки. Оптическую плотность окрашенного раствора измеряли с помощью фотоэлектроколориметра ФЭК-56М (светофильтр №8, ?_эфф = 597±10 нм. кювета 20 мм). Количество выделенного аймалина определяли по калибровочному графику и пересчитывали на весь объем вытяжки. Параллельно исследовали контрольные пробы.

Разработанный метод позволил выделять от 40 до 54 % аймалина в зависимости от его количеств, добавленных к 100 г навески печени трупа человека (см. таблицу). Граница определения аймалина предлагаемым методом составила 0,5 мг в 100 г печени трупа.

Таким образом, разработан метод изолирования аймалина из трупного материала водой, подкисленной серной кислотой до pH 2,0—2,5 с последующей очисткой полученной вытяжки с помощью геля молселскта Г-50. Этим методом можно выделить из биологического материала до 54 % аймалина. Грани

ЛИТЕРАТУРА

1. Крамаренко В. Ф. Химико-токсический анализ. Практикум. Киев. 1982.
2. Лурье Ю. Ю. Справочник по аналитической химии. М., 1979. с. 309; 312.
3. Машковский М. Д. Лекарственные средства. — 8-е изд. М., 1977. ч. 1—2.
4. Lollgen H., Kasperski J., Krekeler H. — Med. Welt (Stuttg. ), 1978, Bd 29. S. 979-983.
5. Noble J., Jornod J., Buhler J.C. — Schwriz. med. Wschr., 1971. Bd 101, S. 672—674.
6. Offenstadt G.. Boisante L., Onimus R., Amstutz Ph. — Ann. med. intern., 1976, vol. 127, p. 662—627.
7. Weiss H., Gulensohn G. — Herz/Kreislauf, 1978, Bd 10, S. 541—544.