Использование текстильных красителей в качестве флюорохрома для обнаружения сперматозоидов

Ограниченный спектр специальных флюорохромов для люминесцентно-микроскопического обнаружения сперматозоидов, довольно высокая стоимость и дефицитность побудили нас изучить возможность использования для этой цели текстильных красителей, а также выяснить оптимальные условия для их применения.

Исследовали 40 текстильных красителей из четырех основных групп — 15 диариловых, 16 идантреновых (кубовых), 6 проционовых и 3 серных. Разница между красителями заключалась в различии химической структуры, а между красителями отдельных групп — в активных группах. Красителями обрабатывали мазки свежей спермы, семенные пятна на различных предметах-носителях различной давности и с разными биологическими примесями (кровь, секрет влагалища, секрет носа и др.). Сперматозоиды окрашивали как в пятне, так и в вытяжке из него. Исследуемый материал наносили на предметное стекло, накапывали 2 капли водного разведения 1:10000 соответствующего красителя и высушивали при 37°. Рассматривали в люминесцентный микроскоп (мы пользовались микроскопом MЛ-2A). Результаты отражены в таблице.

Обозначения: — люминесценция отсутствует; -)- слабая: ++ средняя; + + + сильная; + + + + очень яркая.

Из таблицы видно, что наилучшие результаты дают следующие красители.

1. Диариловые — деорлин лахид желтый-5GL: головка и хвост лю-минесцируют ярко желто-зеленым светом (оптимальное разведение 1:10 000); деорлин ярко-красный-R: головка и хвост люминесцируют желто-зеленым светом, оптимальное разведение 1:5000; сандокрин синий-BRL: ярко окрашивает только головку.
2. Индантреновые — остентрен синий-BCL: головка и хвост люминесцируют ярко-зеленым цветом (оптимальное разведение 1:10000); кубовый ярко-зеленый-С и -Ж: головка и хвост люминесцируют ярко-зеленым цветом (оптимальное разведение 1:10 000). В этой группе некоторые красители, например цибинон серый-BG, дают люминесценцию только головки желтым цветом.
3. Сернистые — шефел коричневый-MR: головка и хвост ярко люминесцируют зеленым цветом при разведении 1:10 000.
4. Проционовые — процион ярко-красный-М8BS: головка люминесцирует красным цветом, а хвост дает слабую люминесценцию этого же цвета (разведение 1:10 000).

Для контрастного люминесцирования головки и хвоста провели комбинированное флюорохромирование. На объект капали по 2 капли двух различных красителей. Самой подходящей оказалась комбинация: процион ярко-красный-М8BS и деорлин лахид желтый-5GL. Головка при этом люминесцирует красным цветом, а хвост — желто-зеленым.

Наши исследования показали также, что некоторые красители, не обладающие флюорохромными качествами в водном растворе при определенном pH среды с использованием буфера, могут оказаться флюорохромами. Например, леофикс золотисто-желтый-Е6 дает сильную люминесценцию с ацетатным и веронал-ацетатным буфером pH 4,0, а с фосфатным буфером при таком же pH его люминесценция слабее. С этим красителем головка люминесцирует красным цветом, а хвост — желто-зеленым. Гликоколевый буфер для этих красителей не годится.

Наш опыт показал, что желательно сначала извлечь сперматозоиды из предмета-носителя, чтобы избежать первичной и вторичной люминесценции ткани. Их лучше всего экстрагировать 0,05% трипсиновым или 0,05% панкреатиновым раствором с последующим центрифугированием или отделением на виброустановке.

Вышеуказанные красители обеспечивают устойчивую яркую люминесценцию спарматозоидов в пятнах давностью более 10 лет, сохранившихся при комнатной температуре. Изготовленные препараты можно хранить много месяцев в качестве вещественного доказательства.

Выводы

1. Текстильные красители деорлин лахид желтый-5GL, остентрен-синий-BCL, кубовый ярко-зеленый-С и -Ж, шефел коричневый-MR можно использовать в качестве флюорохромов для обнаружения сперматозоидов. Полученная люминесценция не уступает люминесценции стандартных флюорохромов, а в некоторых отношениях даже лучше их (ярче и дольше сохраняется).
2. Наилучшие результаты при комбинированном окрашивании для получения контрастной раздельной люминесценции головки и хвоста дают процион ярко-красный-М-8BS и деорлин лахид желтый-5GL.
3. Текстильные красители, которые в водном растворе не имеют флюорохромных качеств, приобретают их при определенном pH среды с использованием буфера. Некоторые красители, как, например, лео-фикс золотисто-желтый-Е6, дают различную по цвету люминесценцию головки и хвоста.
4. Применение в практике текстильных красителей для люминесцентно-микроскопического обнаружения сперматозоидов выгодно благодаря доступности и дешевизне красителей и возможности использовать их в сильно разведенном виде.