О генетически обусловленном полиморфизме диафоразы спермы

Система АВО(Н), полиморфизм которой проявляется в сперме выделителей, часто бывает недостаточной для групповой дифференцировки семенных пятен. Открытие в сперме группового полиморфизма фосфоглюкомутазы и 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, совпадающего с эритроцитарным полиморфизмом этих ферментов, значительно расширило экспертные возможности в этом направлении. Исследования Renninger и Sina (1970), Radam и Strauch (1971), А.С. Гладких (1976) показали возможность выявления групп этих ферментов в свежих пятнах спермы и влагалищных выделений. В то же время очевидна и актуальность для судебной медицины поиска новых генетически обусловленных маркеров спермы, выявляемых в ее следах.

С этой точки зрения весьма интересны исследования Caldwell и соавт. (1976), которые путем электрофоретического анализа спермы с последующим выявлением диафоразной активности открыли три диафоразных фенотипа спермы Dia-1, Dia-2 и Dia-2-l, контролируемых двумя кодоминантными аллелями SD¹ и SD² (sperm diaphorase) в одном аутосомальном локусе. Согласно этой гипотезе, диафоразные фенотипы спермы Dia-1 и Dia-2 являются гомозиготными по соответствующему аллелю SD¹ и SD², а фенотип Dia-2-l — гетерозиготным. Исследовали 52 образца спермы и выявили фенотип Dia-1 в 29, Dia-2-l —в 16 и Dia-2 в 7 образцах, что, согласно закону Харди — Вейн-берга, определило частоту распределения аллелей SD¹ и SD² — соответственно 0,71 и 0,29. Впервые о полиморфизме эритроцитарной диафоразы сообщили Hopkinson и соавт. (1970). Они, а также Detter и соавт. (1970), Tariverdian и соавт. (1970), Potrafki и соавт. (1972) показали, что различные варианты фермента контролируются обычным аллелем Dia¹ и пятью другими редкими аллелями Dia^2-6 в одном аутосомальном локусе. Из-за крайней редкости вариантов эритроцитарной диафоразы этот фермент не изучался судебными медиками.

Диафоразные группы спермы, открытые в 1976 г., также до сих пор никем не изучены в судебно-медицинском отношении.

Мы поставили цель разработать методику выявления диафоразных групп в жидкой цельной сперме и спермолизатах, в гомогенатах яичек, а также в пятнах спермы с учетом возможности использования этого ферментного полиморфизма спермы в судебно-медицинской практике.

Материал и метод. Исследовали сперму 86 мужчин и гомогенаты яичек 24 трупов. Спермолизаты готовили путем многократного замораживания и оттаивания отмытых сперматозоидов с последующим их центрифугированием. Кусочки яичек промывали в дистиллированной воде, гомогенизировали в микрогомогенизаторе с равным объемом физиологического раствора, центрифугировали и исследовали прозрачную надосадочную жидкость. Пятна спермы готовили на хлопчатобумажной ткани и хранили при комнатной температуре. Исследуемый материал разделяли электрофорезом в гелях крахмала и полиакриламида. Электрофорез в крахмальном геле проводили по методике Brewer и соавт. (1967). Основной буфер: 0,9 М трис, 0,5 М Н₃В0₃, 0,2 М ЭДТА (динатриевая соль). Переходный буфер: основной в разведении 1:7. Гелевый буфер: основной в разведении 1 : 10, pH 8,6. Электрофорез проводили 17 ч при 4°С с градиентом напряжения 5 В/см. При использовании полиакриламидного геля применяли метод вертикального диск-электрофореза в плексигласовых трубках. При этом концентрация разделяющего геля составила 7%, а концентрирующего — 3%. Использовали трис-глици-новую буферную систему, pH 8,3, электрофорез проводили 3 ч при силе тока на одну трубку 6 мА. Диафоразную активность выявляли по методу Kaplan и Beutler (1967). В состав инкубационной смеси входил НАД-Н, тетразолиевый МТТ и дихлорфенолин-дофенол.

Результаты исследования. Во всех 86 образцах цельной спермы и соответственно в лизатах отмытых сперматозоидов посредством дискового электрофореза в полиакриламидном геле четко выявлялись диафоразные группы спермы. Dia-1 характеризовалась наличием двух изоферментов (а и с), Dia-2 — также двух изоферментов (Ь и d), а группа Dia-2-l — наличием всех четырех изоферментов (а, Ь, с и d). Эквивалентная смесь спермы Dia-1 и Dia-2 давала электрофоретическую картину гетерозиготной диафоразной группы Dia-2-1, что свидетельствует о двуаллельности системы диафоразы спермы. В наших исследованиях диафоразная группа Dia-1 была определена в 52, Dia-2-1 — в 23 и Dia-2 — в 11 образцах, что определило частоту распределения аллелей SD¹ и SD² соответственно 0,73 и 0,27. Несмотря на небольшое число образцов спермы, исследованных Caldwell и соавт. и нами (52 и 86 соответственно), почти полное совпадение в распределении аллелей, контролирующих диафоразные группы спермы, свидетельствует о благоприятной частоте встречаемости всех трех ее диафоразных групп.

Рис. 1. Групповые диафоразные изоферменты
спермы в геле полиакриламида.
a — пятно спермы 3-недельной
давности; b, c и d — жидкая цельная сперма
трех диафоразных групп.

С целью изучения возможности установления диафоразных групп спермы в трупном материале исследовали гомогенаты яичек 24 трупов.

Хотя некоторый полиморфизм в распределении диафоразных изоферментов в гомогенатах яичек разных трупов и наблюдался, однако он не совпадал с групповым изоферментным спектром сперматозоидов и цельной спермы. Это, по-видимому, можно объяснить присутствием в гомогенатах яичек изоферментов тканевой диафоразы, которые затушевывают групповой изоферментный спектр диафоразы сперматозоидов и препятствуют установлению диафоразных групп спермы.

В большинстве образцов спермы наблюдали высокую диафоразную активность, и лишь в некоторых образцах она была низкой. Это влияло и на возможность выявления диафоразных групп в экспериментальных пятнах спермы. Во всех случаях, когда диафоразная активность цельной спермы была высокой (75 образцов), ее диафоразные группы можно было диагностировать и в пятнах спермы в течение 3—4 нед (рис. 1). В 11 образцах с низкой активностью фермента диафоразные группы могли быть установлены только в пятнах, давность которых не превышала 7—10 дней. Обязательным условием при исследовании пятен спермы с низкой диафоразной активностью являлось добавление в полиакриламидный гель до его полимеризации ко-фермента — НАД-Н в количестве 10 мг на 30 мл геля.

Этим повышалась чувствительность реакции выявления изоферментов в геле полиакриламида, что облегчало диагностику диафоразных групп в пятнах спермы. Однако избыток НАД-Н, внесенного в составные компоненты полиакриламидного геля (например, 25—30 мг на 30 мл геля), затруднял его полимеризацию и несколько искажал электрофоретическую подвижность изоферментов диафоразы, затрудняя ее групповую диагностику.

Для диагностики диафоразных групп спермы мы апробировали и более доступный метод горизонтального электрофореза в крахмальном геле, который многие зарубежные авторы используют для изучения диафоразного полиморфизма эритроцитов человека. Использовали трис-ЭДТА-Н₃В0₃ буферную систему с pH 8,6 по Brewer и соавт. (1967), однако катодный электродный буфер имел вдвое меньшую концентрацию ионов по сравнению с анодным. Для выявления диафоразной активности применили метод агаровой аппликации, причем лучшие результаты были получены при обработке геля агаровым раствором, содержащим 20 мг НАД-Н, 5 мг дихлорфенолиндофенола, 20 мг тетразолиевого МТТ в смеси 25 мл трис-НС1-буфера (0,025 М, pH 8,5) и 25 мл 2% водного агара. Диафоразные зоны спермы выявлялись при 37°С спустя 1 — 2 ч после застывания агара.

Рис. 2. Диафоразные группы спермы в геле крахмала.
Вверху — цельная сперма группы Dia-1; в центре и внизу пятна спермы диафоразных групп Dia-2 и Dia-l соответственно.

Разделение диафоразных изоферментов спермы в геле крахмала было несколько хуже по сравнению с полиакриламидным гелем, однако все же достаточно для дифференцирования диафоразных групп (рис. 2). При исследовании пятен спермы непосредственно перед варкой крахмального геля в гелевый буфер добавляли кофермент НАД-Н — 60 мг на 180 мл геля. До начала электрофореза в электродный буфер катода также добавляли кофермент НАД-Н из расчета 100 мг на 500 мл буфера. Такое добавление, как и в случае с полиакриламидным гелем, повышало чувствительность реакции по выявлению ферментативной активности диафоразы спермы и делало возможной диагностику ее групп в семенных пятнах.

Выводы

1. Показана возможность выявления генетически детерминированных диафоразных групп в цельной сперме, лизатах сперматозоидов и в семенных пятнах.
2. На 86 образцах спермы определена частота встречаемости аллелей SD¹ и SD², контролирующих появление трех диафоразных групп Dia-1, Dia-2-1 и Dia-2, которая составила соответственно 0,73 и 0,27.
3. Для выявления групповых изоферментов диафоразы спермы пригодны методы электрофореза в крахмальном геле и диск-электрофореза в геле полиакриламида.
4. Выявление диафоразных групп в семеных пятнах значительно расширит современные возможности их группового дифференцирования на вещественных доказательствах.