Методика количественного определения углеводов печени при патологоанатомических и судебномедицинских исследованиях

При судебномедицинских исследованиях для суждения о наличии углеводов в печени трупа обычно применяется качественная, так называемая печеночная, проба на сахаристые вещества, дающая лишь грубое представление о количестве углеводов. С помощью этой методики можно определять наличие восстанавливающих веществ, в том числе глюкозы, но не гликогена, который не гидролизуется при получении водного отвара ткани. Различная степень размельчения печеночной ткани и нестойкость реактива Гайнеса, применяемого при печеночной пробе, также отрицательно сказываются на результатах исследований. Однако даже эта несовершенная методика позволила отметить ряд закономерностей в соотношении между углеводами в печени трупа и условиями умирания. Целью нашего исследования явилась разработка методики количественного определения углеводов печени трупа, пригодной для патологоанатома и судебномедицинского эксперта.

Взятие материала на анализ

Непосредственно под мечевидным отростком грудины трупа, по средней линии, вскрывают брюшную полость, приподнимают с помощью пинцета край левой доли печени, отсекают от него кусок ткани весом 3—5 г, разрезают ножницами на мелкие кусочки и переносят их в ступку, на дне которой находится немного измельченной твердой углекислоты. Охлаждающаяся ткань не прилипает к ступке и легче измельчается. Поверх объекта помещают еще немного твердой углекислоты, ступку закрывают стеклом и оставляют на 2—3 минуты. Замороженную ткань растирают с углекислотой до порошкообразного состояния. После испарения углекислоты берут пробы для определения сахара, гликогена и общего количества углеводов.

Определение содержания сахара в печени ¹

В пробирку с меткой на 25 мл вносят 16 мл n/10 NaOH, 4 мл 10% ZnSO₄ и взвешивают. В образовавшийся гидрат окиси цинка прибавляют около 0,5 г тканевой кашицы и взвешивание повторяют для определения количества ткани, взятой на анализ. Пробирку помещают в кипящую водяную баню на 6 минут, охлаждают, добавляют воды до метки, перемешивают и фильтруют через сухой фильтр в сухую посуду (фильтрат можно сохранять на холоду в течение суток). В стаканчики для определения сахара вносят по 2 мл фильтрата (в двух параллельных), прибавляют точно 2 мл п/200 феррицианида калия и далее определение ведут по Хагедорну и Иенсену. Если 2 мл феррицианида окажется недостаточно, анализ повторяют с меньшим количеством фильтрата.

Параллельно проводят слепое определение с одними реактивами и полученную величину, выраженную в миллиграммах глюкозы, вычитают из величины, полученной в опыте. Содержание сахара в печени вычисляют в процентах по отношению к весу влажной ткани.

Описанный метод основан на неспецифической реакции на глюкозу и с его помощью выявляется общее количество восстанавливающих веществ в безбелковом фильтрате печени. Поэтому мы в 27 случаях определили количество несбраживаемых примесей, используя метод, описанный одним из нас ранее. Мы выясняли, меняется ли количество примесей в зависимости от длительности посмертного периода (в пределах 3 суток при 18°) и от уровня содержания сахара в печени.

Таблица 1

Содержание несбраживаемых веществ в безбелковых фильтратах печени трупов при различной длительности посмертного периода и различном количестве сахара (в процентах глюкозы на влажный вес ткани)

Результаты исследования показали (табл. 1), что количество несбраживаемых восстанавливающих веществ в печени, выраженное в глюкозе, колебалось от 0 до 0,16%,. Отсутствие несбраживаемых примесей было обнаружено только в одном, а величины выше 0,1% лишь в 4 из 27 наблюдений. Не наблюдалось зависимости между содержанием в печени несбраживаемых примесей и длительностью хранения трупа. Минимальные и максимальные величины несбраживаемых примесей были найдены как при высоком, так и при низком содержании сахара в печени. Следовательно, содержание несбраживаемых примесей не зависело от количества сахара в печени. Это дает основание считать, что нет необходимости определять несбраживаемые примеси каждый раз, когда исследуется количество сахара в печени трупа. Считаем целесообразным из получаемого количества сахара печени вычитать поправку, равную 0,8%, являющуюся средним арифметическим из 27 определений несбраживаемых веществ в безбелковых фильтратах печени трупов.

Определение содержания гликогена в печени

В центрифужную пробирку наливают 10 мл свежеприготовленной смеси 1 объема 60% КОН с 3 объемами 90%' этилового спирта и взвешивают. Добавляют около 0,5 г тканевой кашицы и взвешивание повторяют для определения веса взятой ткани. Содержимое пробирки хорошо перемешивают стеклянной палочкой, нагревают в течение 10 минут на водяной бане при 80—85°, постоянно его помешивая. Затем переносят пробирку в кипящую водяную баню, ее содержимое доводят до кипения при постоянном помешивании. Охлаждают, центрифугируют в течение 30 минут при 3000 об/мин. Жидкость сливают, к осадку гликогена добавляют 10 мл 70%, этилового спирта, доводят до кипения на водяной бане, охлаждают и центрифугируют в течение 10 Минут. Жидкость сливают, осадок обрабатывают так же еще раз 70% спиртом и затем 95 % спиртом. После сливания спирта осадок просушивают, помещая пробирку на несколько минут в кипящую водяную баню.

В пробирку с отмытым и просушенным осадком Гликогена отмеривают 10 мл nНС1 и производят гидролиз гликогена при нагреваний на кипящей водяной бане в течение 2 часов, прикрыв пробирку грушевидной стеклянной пробкой. Гидролизат количественно переносят в пробирку с меткой на 25 мл, прибавляют одну каплю 0,1% водного раствора фенолрота и нейтрализуют вначале 60%, КОН до получения светлой лимонно-желтой окраски, а затем п КОН до ярко-малиновой окраски, которая снимается одной каплей n НС1. Добавляют воды от метки и фильтруют через сухой фильтр в сухую посуду. Отмеривают по 2,5 мл фильтрата (в двух параллельных) для определения восстанавливающих веществ по Хагедорну и Иенсену.

Параллельно ставят «слепой» опыт: берут 10 мл НСl, нейтрализуют едким кали по фенолроту и далее определение ведут так же, как в основном опыте. Полученную величину, выраженную в миллиграммах глюкозы, вычитают из величины, полученной в основном опыте, и разность, если необходимо, умножают на 0,927 Для пересчета глюкозы на гликоген. Содержание гликогена в печени вычисляют в процентах на вес влажной ткани.

Определение общего количества углеводов печени

Для определения общего количества углеводов печени трупа мы рекомендуем проводить кислотный гидролиз печеночной ткани, так как, помимо глюкозы и гликогена, в ней могут содержаться продукты неполного распада последнего.

В пробирку с меткой на 25 мл вносят 15 мл nHCl и взвешивают. Добавляют около 1 г тканевой кашицы и взвешивание повторяют для определения количества ткани, взятой на анализ. Перемешивают содержимое, пробирку прикрывают грушевидной стеклянной пробкой и производят гидролиз полисахаридов при нагревании на кипящей водяной бане в течение 2 часов. Пробирку охлаждают, содержимое доводят водой до метки, перемешивают и фильтруют через сухой фильтр в сухую посуду. В пробирку на 25 мл вносят 1 мл фильтрата (раствор I), прибавляют одну каплю 0,1% водного раствора фенолрота и нейтрализуют nNaOH до получения лимонно-желтой окраски, а затем п/10 NaOH до ярко-малиновой окраски, которая снимается одной каплей п/10 НС1. Доводят водой до метки (раствор II), перемешивают, 2,5 мл раствора (в двух параллельных) вносят в стаканчики для определения сахара, прибавляют 2 мл п/200 феррицианида калия и далее определение ведут по Хагедорну и Иенсену. Если 2 мл феррицианида оказывается недостаточно, анализ повторяют с меньшим количеством раствора II.

Параллельно проводят «слепое» определение с реактивами, вносят в пробирку с меткой на 25 мл 0,5 nНС1, нейтрализуя и далее ведя анализ, как в опытной пробе. Полученную величину, выраженную в миллиграммах глюкозы, вычитают из величины, полученной в опыте. Содержание углеводов печени вычисляют в процентах глюкозы на влажный вес ткани.

Ввиду того что предлагаемый метод основан на неспецифической реакции на глюкозу и выявляет общее количество восстанавливающих веществ в гидролизате печени, мы в 25 случаях определили количество несбраживаемых примесей. При этом 10 мл раствора I нейтрализовали по фенолроту сначала 5 п NaOH, затем п/10 NaOH, доводили до 25 мл и далее брали по 2,5 мл на сбраживание пекарскими дрожжами.

Результаты исследования печени, взятой у трупов на 1—4-е сутки после смерти, показали, что количество несбраживаемых восстанавливающих веществ кислого гидролизата печени, вычисленное в процентах глюкозы на влажный вес ткани, колебалось от 0,3 до 0,67%,, т. е. являлось довольно постоянной величиной, составляя в среднем из 25 наблюдений 0(5%. Полагаем, что нет необходимости каждый раз определять несбраживаемые примеси, когда исследуют общее количество углеводов печени трупа. Целесообразнее из полученной величины содержания углеводов вычитать поправку на несбраживаемые примеси — 0,5 г глюкозы на 100 г ткани.

Для проверки точности метода мы провели анализы печеночной ткани собак, находившихся под неглубоким нембуталовым наркозом, условно приняв это за норму. В таких случаях суммарное количество раздельно определенных сахара и гликогена должно быть близким к общему количеству углеводов, определенных методом кислотного гидролиза, так как в норме декстринов в печени не содержится, и поэтому кислотный гидролиз не должен приводить к распаду глюкопротеидов. Действительно, как видно из табл. 2, данные общего содержания углеводов печени у одной и той же собаки в состоянии условной нормы оказались очень близкими при определении разными методами.

Таблица 2

Содержание сахара, гликогена и общего количества углеводов в печени собак (в процентах глюкозы к влажному весу ткани)

Мы исследовали зависимость между содержанием углеводов в печени и длительностью посмертного периода. У собак под неглубоким нембуталовым наркозом брали пробу печени для определения исходного количества углеводов. После этого собак убивали путем быстрого обескровливания и последующие пробы брали через разные сроки после наступления смерти. Трупы собак сохранялись при температуре от 7 до 10°. Взятие каждый раз нового кусочка печени, естественно, несколько искажало результаты, так как исходное содержание углеводов в них могло варьировать. Пробы брали по краю печени, учитывая при этом, что содержание гликогена увеличивается к середине доли. Например, в пробе ткани, взятой из края печени, количество гликогена составило 1,65 %₍, а в пробах ткани, одновременно взятых из участков, расположенных на глубине 10 и 15 см, количество гликогена было соответственно 1,97 и 1,96%.

Содержание гликогена в печени значительно уменьшается уже в первые сутки после наступления смерти и одновременно возрастает содержание сахара     (рис.1). В то же время общее количество углеводов печени в течение 2 суток после смерти меняется незначительно (рис. 2). Заметное уменьшение общего количества углеводов печени наблюдается лишь на 3-и сутки после смерти. Таким образом, только по общему количеству углеводов печени на протяжении 2 суток после смерти можно составить представление об их содержании перед умиранием.

Выводы

1. Разработан метод количественного определения углеводов печени трупа путем кислотного гидролиза.
2. В течение 2 суток после смерти по содержанию углеводов в печени трупа, определенному методом кислотного гидролиза, можно судить о том их количестве в печеночной ткани, которое имелось перед смертью.
3. Количество несбраживаемых восстанавливающих веществ в кислом гидролизате печени относительно постоянно на протяжении 4 суток после смерти и составляет в среднем 0,5%, в расчете на глюкозу по отношению к влажному весу ткани.
4. Количество несбраживаемых восстанавливающих веществ в безбелковом фильтрате печеночной ткани составляет в среднем 0,08% в расчете на глюкозу по отношению к влажному весу ткани.

¹ В основу положена методика Керра для определения углеводов в ткани мозга.