Обнаружение финлепсина в трупном материале

Финлепсин применяется при лечении эпилепсии и невралгии тройничного нерва. Это белый кристаллический порошок, не растворимый в воде и хорошо растворимый в этиловом спирте, хлороформе и ацетоне. При приеме больших доз может наступить смертельное отравление.

В доступной литературе мы не встретили описания отравления финлепсином и методов обнаружения его в биологическом материале. Учитывая это, сообщаем наши наблюдения.

Гр-ну К., страдавшему эпилепсией, было выписано 2 флакона по 50 таблеток с содержанием по 200 мг финлепсина в каждой. Через некоторое время он поступил в нервное отделение районной больницы, где вскоре умер. Клинический диагноз — острое отравление финлепсином.

При судебно-химическом исследовании внутренних органов найден финлепсин. Изолирование проводили извлечением подкисленной водой, из кислого водного извлечения (pH 2,5) экстрагировали хлороформом 4 раза порциями 15, 15, 10 и 10 мл. Экстракты объединяли в мерной колбе вместимостью 50 мл, аликвоты исследовали. При испарении хлороформного экстракта на предметных стеклах наблюдали небольшие кристаллы в виде темных палочек и иголок (рис. 1, см. вклейку). Идентифицировали приведенными ниже реакциями. Положительные результаты позволили утверждать о нахождении финлепсина в содержимом желудка, тонкой кишке, печени и почке.

Рис. 1. Кристаллы финлепсина, полученные из хлороформного раствора. Ув.10×8.

Проведенными опытами на водно-спиртовых растворах установили, что финленеин одинаково хорошо извлекается хлороформом в интервале pH от 2,0 до 10,0.

Для изучения зависимости экстракции хлороформом от pH среды 100 мг вещества растворяли в 3—4 мл этанола, количественно переносили в делительную воронку, добавляли 20 мл воды, добавлением раствора щавелевой кислоты или раствора аммиака устанавливали необходимую pH среды и экстрагировали хлороформом 4 раза порциями 15, 15, 10 и 10 мл. Экстракты помещали во взвешенную чашку, хлороформ испаряли при комнатной температуре, остаток доводили до постоянного веса и количество экстрагированного финлепсина определяли весовым методом. При отсутствии балластных веществ метод достаточно точный и позволяет определить незначительное количество вещества. Установили, что хлороформом из кислого водного извлечения экстрагируется практически все вещество и в щелочное извлечение ничего не переходит.

Идентификацию проводили реакциями окрашивания и микрокристаллической реакцией. Для определения специфичности реакций поставили опыты с рядом противоэпилептических средств (фенобарбитал, бензонал, гексамидин, дифенин, триметин, хлоракон, мидокалм, глутаминовая кислота), а также с веществами, содержащими амидо-, имидо- и аминогруппы (оксафенамид, салициламид, кордиамин, никотинамид, никодин, новокаинамид, этимизол, севин).

Финлепсин, имеющий в структуре бензольные кольца, способен нитроваться, давая желтую окраску, которая при воздействии спиртового или водного растворов едкого натра переходит в фиолетовую.

Проведение реакции. К остатку на чашке прибавляли 10 капель концентрированной азотной кислоты, испаряли досуха на кипящей водяной бане, при этом появлялось желтое окрашивание. Остаток еще 3 раза обрабатывали концентрированной азотной кислотой порциями по 10 капель и вновь выпаривали на бане досуха, охлаждали и прибавляли 1—2 капли спиртового или водного раствора едкого натра, при этом образовывалось фиолетовое, а при большом количестве вещества темно-фиолетовое окрашивание. При добавлении капли воды темно-фиолетовое окрашивание переходило в светло-фиолетовое, которое при стоянии переходило в грязно-фиолетовое, а затем постепенно исчезало. Чувствительность реакции 3 мкг в пробе¹. Реакция специфична. Фенобарбитал, бензонал, гексамидин, триметин, мидокалм, глутаминовая кислота, кордиамин, никотинамид и этимизол окрашивания не давали. Дифенин, хлоракон, оксафенамид, салициламид, никодин, севин давали желтое илетло-желтое окрашивание; новокаинамид — буро-коричневое.

Алкалоиды группы пропана (атропин, скополамин) давали фиолетовое окрашивание, но они извлекались хлороформом только из щелочной среды.

Алкалоиды чемерицы (вератрин) хотя и переходят в кислый и щелочной экстракт при экстракции хлороформом, однако после нитрования азотной кислотой и взаимодействия со спиртовым раствором едкого натра они дают фиолетовое или чаще красно-оранжевое окрашивание, в то время как финлепсин дает темно-фиолетовое окрашивание.

При окислении финлепсина перекисью водорода в присутствии серной кислоты образуется желтое окрашивание и бирюзовая флюоресценция при облучении УФ-лучами.

Проведение реакции. К остатку на чашке прибавляли 2 капли 10% раствора серной кислоты, нагревали на кипящей водяной бане 2—3 мин, прибавляли 1 каплю 3% раствора перекиси водорода, нагревали на бане еще 2—3 мин, при этом наблюдали желтое окрашивание. Содержимое чашки в УФ-свете давало бирюзовую флюоресценцию. Реакция окрашивания специфична, чувствительность ее 3 мкг. Фенобарбитал, бензонал, дифенин, триметин, хлоракон, глутаминовая кислота, салициламид, никодин и этимизол окрашивания не образуют и не флюоресцируют. Не флюоресцируют, но образуют окрашивание мидокалм — слабо-буроватое; новокаинамид — желтое,, быстро исчезающее; севин — красновато-коричневое. Оксафенамид образует грязнобурое окрашивание, а в УФ-свете излучает голубую флюоресценцию. Гексамидин, кордиамин и никотинамид окрашивания не образуют, но в УФ-свете флюоресцируют: первый — бирюзовым, второй — голубым, третий — сине-фиолетовым цветом.

Финлепсин при нагревании с раствором ванадата аммония в концентрированной серной кислоте образует желтовато-зеленое окрашивание. При количестве финлепсина больше 10 мкг окраска усиливается.

Проведение реакции. К остатку на чашке прибавляли 2 капли дистиллированной воды, 2 капли насыщенного раствора ванадата аммония в концентрированной серной кислоте, перемешивали стеклянной палочкой (при этом оранжевый цвет раствора ванадата исчезал и оставалось только желтоватое окрашивание), нагревали на кипящей водяной бане 5 мин — образовывалось желтовато-зеленое окрашивание. В контрольном опыте с реактивами при тех же условиях получалось оранжевое окрашивание. Чувствительность реакции 10 мкг. Реакция неспецифична, так как похожее окрашивание образуют многие вещества (фенобарбитал, бензонал, дифенин, салициламид, триметин, хлоракон, мидокалм).

Финлепсин с раствором хлористого йода образует желтые кристаллы.

Проведение реакции. К остатку на предметном стекле добавляли 1 каплю 0,8% раствора хлористого йода, стекло выдерживали во влажной камере 5—10 мин, при этом появлялись желтые кристаллы: при большом количестве — в виде неправильных закругленных призм, а при малом — в виде удлиненных чечевичек или удлиненных призм часто с расщепленными концами (рис. 2, см. вклейку). Реакция специфична, чувствительность ее 0,3 мкг. Бензонал, гексамидин, дифенин, триметин, хлоракон, глутаминовая кислота, оксафенамид, салициламид, кордиамин, никотинамид, никодин, новокаинамид, этимизол, севин с хлористым йодом кристаллов не образуют. Фенобарбитал и мидокалм образуют кристаллы другого строения.

Рис. 2. Кристаллы, полученные при взаимодействии финлепсина с раствором хлористого йода. Ув. 10×8.

Финлепсин в хлороформном растворе образует характерные кристаллы. На предметное стекло наносили каплю хлороформного раствора, испаряли на воздухе, остаток на стекле увлажняли дыханием; под микроскопом наблюдали кристаллы в виде палочек и иголок (см. рис. 1, на вклейке). Чувствительность реакции 0,1 мкг. Фенобарбитал, бензонал, триметин, мидокалм, глутаминовая кислота, кордиамин, никодин, новокаинамид из хлороформных растворов кристаллов или налета не образуют. Гексамидин, дифенин, хлоракон, оксафенамид, салициламид, никотинамид, этимизол и севин, образуют кристаллы или кристаллические налеты другого строения, поэтому получение характерных кристаллов финлепсина из хлороформных растворов является одним из специфичных доказательств.

Тонкослойную хроматографию проводили на пластинке размером 9X12 см с закрепленным слоем силикагеля КСК (состав массы на одну пластинку: силикагель 2,6 г, гипс 0,14 г, дистиллированная вода 7,5 мл). Система растворителей: хлороформ — ацетон (9:1). В УФ-свете финлепсин дает фиолетовую флюоресценцию (Rf 0,38—0,45), кроме того, наблюдается свечение фиолетовым светом в положении 0,61—0,65 и голубое свечение в. положении R_f 0,76—0,80. При проявлении реактивом Драгендорфа, модифицированным по Мунье, проявляются красно-коричневые пятна с Rf 0,38—0,45, другие флюоресцирующие пятна не проявляются. При последующем опрыскивании хроматограммы 10% раствором хлорида окиси железа окраска проявленного пятна усиливается и переходит в буровато-коричневую. Чувствительность реакции обнаружения реактивом Драгендорфа 9 мкг, а реактивом Драгендорфа и последующим опрыскиванием раствором хлорного железа — 1 мкг в пятне.

Выводы

1. Изложен метод изолирования финлепсина подкисленной водой с последующей экстракцией хлороформом. Установлено, что он экстрагируется хлороформом одинаково хорошо в интервале pH от 2,0 до 10,0.
2. Для идентификации предложены три цветных реакции, одна микрокристаллическая и по образованию характерных кристаллов при кристаллизации из хлороформа, а также изучены условия хроматографического исследования в тонком слое силикагеля.
3. Определена чувствительность и специфичность каждой реакции.

¹ Здесь и в следующих реакциях чувствительность определяли на растворах чистого препарата.