Выделение барбамила и барбитала из биологического материала с помощью метода гель-хроматографии

Для выделения барбитуратов из биологического материала применяют различные методы: Стаса-Отто (1851, 1856), А.А. Васильевой (1949), В.П. Крамаренко (1962) и др. При этом основные затруднения связаны с очисткой полученных вытяжек от примесей. При соблюдении условий очистки вытяжек все же получаются остатки, в большей или меньшей степени содержащие примеси, что не позволяет определять в них барбитураты спектрофотометрическим и другими чувствительными методами. Поэтому мы разработали новую методику выделения этих веществ, основанную на изолировании их подкисленной водой по методу В.П. Крамаренко (1962) с последующей очисткой вытяжек с помощью гель-хроматографии.

Экспериментальная часть

100 г измельченного биологического материала (печень, почки, мозг) помещали в стакан, заливали 0,02 н. раствором серной кислоты (80 мл), жидкость доводили 30% раствором серной кислоты до pH 2,0—3,0 и оставляли на 2 ч при периодическом перемешивании. После этого вытяжку сливали, материал еще 2 раза заливали новыми порциями 0,02 н. серной кислоты (по 80 мл) и каждый раз настаивали по 1 ч. Вытяжки объединяли, процеживали через 3 слоя марли и измеряли объем. Затем вытяжку центрифугировали (13 000—15 000 об/мин) в течение 20—30 мин. 50 мл (или 25 мл) отцентрифугированной вытяжки вносили в колонку (40x2,5 см), заполненную гелем сефадекса G-25 (размер частиц в сухом состоянии 100—300 мкм). На полиэтиленовой трубке в нижней части колонки открывали зажим, внесенная в колонку вытяжка впитывалась гелем (при этом над гелем всегда должен оставаться небольшой слой жидкости). После впитывания жидкости гелем в колонку дважды вносили по 2 мл 0,02 н. раствора серной кислоты (каждый раз открывая зажим, что обеспечивало полное впитывание жидкости гелем).

Для элюирования барбитуратов колонку соединяли с установленным выше сосудом, заполненным 0,02 н. раствором серной кислоты, и открывали зажим внизу колонки. Первые 150 мл элюата отбрасывали, а следующие 200 мл элюата (в котором содержатся барбитураты) переносили в делительную воронку и прибавляли, 50 мл хлороформа. Содержимое делительной воронки взбалтывали в течение 10 мин. Экстрагирование барбитуратов новыми порциями хлороформа (по 50 мл) производили еще 2 раза. Хлороформные вытяжки объединяли, выпаривали при 40°С досуха. Барбитураты определяли в сухих остатках спектрофотометрическим методом (по светопоглощению в УФ-области спектра). Для этого сухой остаток растворяли в 25 мл 0,3 н. раствора едкого натра, затем прибавляли 75 мл насыщенного раствора буры и измеряли оптическую плотность полученных растворов с помощью спектрофотометра СФ-4А (кювета 1 см). Оптическую плотность раствора барбамила измеряли при длине волны 239 нм барбитала — при длине волны 240 нм Расчет содержания выделенных

а оптическую плотность раствора, производили по формуле:

где А—количество барбитурата в пробе (в мг); D — оптическая плотность; Е 1% 1см— удельный показатель поглощения исследуемого барбитурата; I — толщина слоя жидкости в кювете (в см); V — общий объем вытяжки (в мл); V1 — объем вытяжки, пропущенной через гель сефадекса (в мл).

Исследования показали, что при содержании 40 мг барбитуратов; в 100 г биологического материала можно выделить 39—46% барбамила и 27—29% барбитала.

Кроме того, провели опыты по выделению указанных барбитуратов из биологического материала другими методами (В.И. Попова, 1967; В.И. Попова и В.П. Крамаренко, 1970). Количественное определение барбитуратов, выделенных методами Стаса-Отто, А.А. Васильевой, В.Ф. Крамаренко, а также Валова, производили фотоэлектроколо-риметрическим методом, основанным на реакции взаимодействия барбитуратов с ацетатом кобальта и изопропиламином. Очистку выделенных барбитуратов проводили с помощью вольфрамата натрия (Валов, 1946).

Результаты выделения барбамила и барбитала различными методами приведены в таблице.

Мы установили также границы обнаружения и количественного определения барбамила и барбитала.

Выделение барбитуратов различными методами

Для этого к 100 г измельченной печени прибавляли водные растворы, содержащие различные количества соответствующих препаратов (2, 3, 5, 10, 20, 40 и 50 мг). Смеси оставляли на сутки при периодическом перемешивании, барбитураты выделяли по указанной выше методике.

Для идентификации барбитуратов применяли мурексидную реакцию. Сухие остатки растворяли в 2 мл хлороформа и растворы переносили в фарфоровые чашки. Хлороформ выпаривали на водяной бане досуха. К сухим остаткам прибавляли по 3 капли перекиси водорода и по 3 капли реактива*. Смеси выпаривали досуха на небольшом пламени газовой горелки, а затем продолжали нагревание сухих остатков до появления белых паров. Полученные сухие остатки охлаждали и прибавляли по 3 капли 6 н. раствора аммиака. В присутствии барбамила и барбитала появлялось розовое окрашивание. Этой реакции не дают гексенал, гексобарбитал и циклобарбитал.

Для идентификации барбитуратов при помощи методов хроматографии в тонком слое сорбента и газожидкостной хроматографии сухие остатки растворяли в 1 мл ацетона. Ацетоновые растворы упаривали до получения небольших объемов (0,5 мл). Для исследования барбитуратов методом газожидкостной хроматографии брали по 5 мкл указанных растворов и вводили в хроматограф. Остальную часть ацетоновых растворов барбитуратов использовали для обнаружения их с помощью метода хроматографии в тонком слое силикагеля КСК

Количественное содержание каждого барбитурата определяли спектрофотометрически, как указано выше.

Проведенные исследования показали, что с помощью метода, основанного на измерении светопоглощения барбитуратов в УФ-области спектра, в 100 г биологического материала можно определить около 5 мг барбитуратов.

При помощи мурексидной реакции можно обнаружить 2 мг барбамила и 3 мг барбитала, прибавленных к 100 г биологического материала и выделенных с помощью предлагаемой нами методики.

Методом хроматографии в тонком слое силикагеля КСК и методом газожидкостной хроматографии можно обнаружить 2 мг барбамила и 2 мг барбитала в 100 г биологического материала.

Проведенные нами опыты по выделению барбамила и барбитала из гнилостно-разложившегося материала показали необходимость дополнительной очистки полученного хлороформного извлечения. Для этого хлороформное извлечение, содержащее барбитурат, взбалтывали 2 раза (по 25 мл в течение 5—7 мин) с 0,1% раствором едкого натра.

Затем водную вытяжку подкисляли 30% раствором серной кислоты до pH 2,0—3,0 и барбитураты экстрагировали хлороформом 3 раза (по 50 мл в течение 10 мин). Хлороформные извлечения объединяли, взбалтывали с сульфатом натрия (5—7 г) и выпаривали досуха. В сухих остатках определяли барбитураты.

Исследования показали, что после 6-месячного хранения биологического материала, содержащего барбитураты, определяется 34—36% барбамила и 17—21% барбитала.

Выводы

1. Разработана методика выделения барбамила и барбитала из биологического материала, основанная на изолировании этих веществ водой, подкисленной серной кислотой, и на последующей очистке вытяжек от примесей с помощью метода гель-хроматографии.
2. По указанной методике выделяется из биологического материала 39—46% барбамила и 27—29% барбитала.
3. Граница обнаружения при использовании мурексидной реакции для барбамила составляет 2 мг, для барбитала — 3 мг (прибавленных к 100 г материала и выделенных по предлагаемой методике).
4. Граница количественного определения спектрофотометрическим методом (УФ-область) составляет 5 мг барбамила и барбитала (прибавленных к 100 г материала).
5. При хранении около 6 мес биологического материала, содержащего барбитураты, определяется 34—36% барбамила и 17—21% барбитала.

* К 1 г соли Мора (NH₄)₂Fe (SO4)2.6H2O прибавляли 0,5 мл соляной кислоты (удельный вес 1,12) и воду до 100 мл. К 5 мл этого раствора добавляли 4 г хлорида аммония и воду до 100 мл. Полученную жидкость использовали в качестве реактива.