Токсическое действие производных фенотиазина и методы их определения в биологических жидкостях (Обзор)

Фенотиазин (тиодифениламин) широко применяют в народном хозяйстве, ветеринарной и медицинской практике. Он токсичен для человека, вызывает острую гемолитическую анемию, поражение печени и почек. По данным Harper с соавторами, 40% введенного через рот фенотиазина выделяется с мочой в неизмененном виде.

Для обнаружения фенотиазина предложены следующие реакции: окисление бромной водой (при последующем нагревании образуется малиновое окрашивание); окисление бромом или бромной водой в присутствии диметиламина (продукт реакции окрашен в синий цвет за счет образования метиленового синего); окисление спиртовым раствором хлорида окисного железа (образуется зеленое окрашивание); окисление концентрированной серной кислотой (образуется малиновое окрашивание, переходящее в желто-зеленое). Porter и Spiller определили кристаллооптические константы микрокристаллов фенотиазина.

Oliver с соавторами разработали методику определения фенотиазина в тканях животных, позволяющую раздельно определять фенотиазин и его метаболиты (фенотиазон, тионол и фенотиазин-5-оксид). Методика основана на хроматографическом разделении экстрагированных соединений, элюировании и проведении хромогенных реакций и количественной спектрофотометрии. Brierley и Langbrige использовали метод ультрафиолетовой спектроскопии (при 254, 5 ммк) для определения фенотиазина в продажных препаратах. Усами Сиро предложил полярографическое определение дифениламина и фенотиазина.

Синтез производных фенотиазина развивался очень бурно. В 1944 г. были синтезированы аминопроизводные фенотиазина. В 1950 г. Charpentier синтезировал хлорпромазин. В конце второй мировой войны в США и во Франции синтезировали диетазин и прометазин. В СССР М.Н. Щукина с соавторами синтезировали аминазин.

Аминазин обладает различными фармакологическими свойствами. Он хорошо всасывается из желудочно-кишечного тракта, при внутривенном введении быстро проникает в центральную нервную систему и уровень аминазина в ней по сравнению с плазмой крови достигает 20-кратных величин (Salzman и др. ). При передозировке нарушает кровообращение, вызывает общую слабость, головную боль обморок, иногда холинолитические реакции и аллергические симптомы. Длительное употребление аминазина вызывает лейкопению вплоть до агранулоцитоза (Prokopowicz, Carfagno с соавторами), желтуху (Zelman; Kohn с соавторами). Аминазин и его аналоги вызывают умеренное привыкание (Benson). Данные о токсичности разноречивы.

Так, Samuels и Lazar показали, что даже доза 2500—6000 мг. принятая с целью самоубийства, несмертельна. Аминазин обладает кумулятивными свойствами и длительно выводится из организма, поэтому могут наблюдаться смертельные отравления и при приеме обычных терапевтических доз его (Е.О. Ольшанский и В.В. Морозов, и др. ). Случаи острых и смертельных отравлений описали Malone, Marcinkowski, Norman, Sabon, Fatteh Abdullah, Forrest F. с соавторами, Г.А. Невзорова и A. T. Macлиев и др. Описаны и комбинированные отравления аминазином или его производными с другими веществами (Frydl, Marcinkowski и др. ). Kottgen и Kuschinsky указали 8 случаев развития гемолитической анемии при лечении детей противоглистными средствами, содержащими фенотиазин. Sabon и Viala описали случай самоубийства одновременным приемом хинина, хлоргидрата прометазина и аспирина. Malone, Norman, Francova и Franc и др. указывают на избирательное поражение печени при назначении фенотиазина и аминазина. Описаны также и производственные отравления аминазином.

Как правило, для доказательства отравления аминазином или его аналогами клинического, анатомического, микроскопического и гистологического исследований недостаточно, необходимо точное определение аминазина и его производных в крови, моче и органах.

Для этого применяют различные окислители и сочетания их в комбинации с различными методами анализа.

Для выделения и определения аминазина в биологических жидкостях и тканях наиболее часто применяют метод Dubost и Pascal, позволяющий определять как свободный, так и связанный ларгактил. Его экстрагируют эфиром из щелочной среды, а остаток после улетучивания эфира обрабатывают концентрированной серной кислотой (d-1, 83), при этом наблюдается кармино-красное окрашивание. Чувствительность реакции 1: 80 000. Количественное определение проводят на электрофотометре. Авторы определяли до 8% ларгактила, введенного орально или внутривенно собакам и кроликам. Несмотря на то что работами Forrest F и Forrest I., Cekon, Clarke, Rosenthaler доказана неспецифичность реакции аминазина с концентрированной серной кислотой, преимущество ее заключается в образовании окрашивания как с фенотиазином и его производными, так и с их метаболитами; отрицательный результат позволяет исключить производные фенотназина.

Leach и Crimmin, изучив влияние окисляющих агентов на окраску, получаемую при окислении хлорпромазина, отметили, что красная окраска наиболее удобна для колориметрического определения при использовании в качестве окислителя приведенного выше реактива. Она стабильна в течение 1 чага и подчиняется закону Ламберта—Вера при 530 ммк—100 мкг. Хлорпромазин экстрагировали эфиром из щелочной среды с последующей реэкстракцией эфирного извлечения 0, 1 н. раствором серной кислоты. Этим методом определяется 87—94% хлорпромазина, добавленного к моче, 87—92% добавленного к крови. Для определения аминазина в биологических жидкостях и выделениях Л.И. Гребенник использовал 3 реакции: 1) появление розового окрашивания с серной кислотой: 2) образование соли основания аминазина с метилоранжем; 3) помутнение раствора аминазина при взаимодействии с раствором йодида ртути в йодиде калия. Однако две последние реакции неприменимы к исследованию биологического материала, так как они дают положительный результат со многими веществами основного характера. Аминазин экстрагируется из щелочной среды бензолом или эфиром, содержащим 1 изоамилового спирта. Автор установил, что в течение 4 суток крысы выделяют 44, 4% аминазина и продуктов его распада при подкожном введении и 51, 6% л введении в желудок.

По методу Hetzel мочу или сыворотку крови экстрагируют эфиром из щелочной среды с последующей реэкстракцией эфирного извлечения 2 мл 0, 1 н. раствора серной кислоты. Сернокислую фазу отделяют. Нитропроизводные фенотиазина определяют спектрофотометрически. Для этого к экстракту добавляют 4 мл азотной кислоты (d = 1, 43) и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10—20 мин., затем охлаждают и колориметрируют при 370 ммк (для аминазина). Автор установил, что концентрация фенотиазиновых производных достигает максимума через 7—12 часов после приема; за сутки выделялось 7. 5% этих соединений с мочой (для доз 25—100 мг). В сыворотке крови через час после приема концентрация достигла 0, 5 мг/мл. Nadeau и Sobolewski разработали метод выделения и определения производных фенотиазина в моче как в свободной, так и в связанной форме. Свободные формы экстрагируют изобутанолом из щелочь среды, с помощью буферного раствора (pH 3, 0) переводят в водную фазу и определяют по реакции с йодплатиновым реактивом. Интенсивность голубого окрашивания определяют при 610 ммк. Для выделения связанных форм применены различные способы гидролиза: 1) энзиматический — с помощью бактериальной ?-глюкуронидазы (Ketodase); 2) кислотный — с помощью концентрированной соляной кислоты: 31 щелочной — с помощью 10% раствора едкого натра. При этом отмечено, что гидролиз хлорпромазина проходит более полно в среднекислой среде. Определяется до 86% производных фенотназина, содержащихся в моче. Экспериментальные данные проверены на пациентах, получавших ежедневно от 75 до 300 мг хлорпромазина: в суточном количестве мочи определено от 9, 5 до 20, 3 мг хлорпромазина. Sano и Kajita применили бумажную хроматографию для разделения производных фенотиазина, использовав для идентификации спиртовый раствор концентрированной серной    кислоты. Различные производные фенотиазина и продукты их распада окрашиваются в красный, синеватый или фиолетовый цвет. Этим методом можно определить до 0. 5 мкг.

Emergy, используя хроматографию, определил, что при назначении аминазина в дозах 300    800 мг в сутки с мочой выделяется от 7 до 9% его. Связанный хлорпромазин определяется в моче в течение 2 дней, а свободный и связанный сульфоксид — в течение 4 ил 11 дней Хлорпромазин-N-оксид дает положительную реакцию с реактивом Драгендорфа, отрицательную — с нитропруссидом натрия и нингндрином, имеет постоянное значение Rf, ультрафиолетовый спектр и катионные свойства и выделяется с мочой в количестве около 0, 6%.

Хроматографические методы широко используют для определения производных фенотиазина. Eisdorfer и Ellenbogen применили восходящую и радиальную бумажную хроматографию для обнаружения продуктов обмена хлорпромазина, полученных в результате N-деметилирования и окисления сульфида. Мочу хроматографируют в одной и той же системе растворителей: дихлорэтанбензол — муравьиная кислота (88% раствор) — вода (3:1:4:2). Полученные хроматограммы опрыскивают йодплатиновым реактивом или идентифицируют в ультрафиолетовом свете. С помощью данного метода можно определить 1—2 мкг вещества. Burger и Berninger предложили определять производные фенотиазина с помощью хроматографии на бумаге и спектрофотометрии (мочу экстрагируют смесью равных частей бензола, эфира и гексана при pH 9, 0). Хроматографируют восходящим методом на забуференной бумаге (pH 3, 5; 5, 6; 7, 5); в качестве растворителя используют бутанол и соответствующий буфер. Проявляют хлоридом палладия, хроматограмму исследуют в ультрафиолетовом свете. Метод позволяет определять 6 производных фенотиазина. Граница извлечения 1 мкг.

Интересна работа Rieder о спектрофотометрическом определении производных фенотиазина и тиоксантена, которые идентифицируют по спектрам поглощения в видимой области спектра окрашенных растворов этих соединений, образуемых при действии на них хлоридом окисного железа в присутствии серной кислоты. К 1 мл водного 0, 5—2 - 10—⁴ М раствора вещества прибавляют 2 мл 0, 01% раствора хлорида железа в 65% растворе серной кислоты и спектрофотометрируют при 330—750 ммк. Метод позволяет идентифицировать производные фенотиазина. имеющие заместители в ядре (Н, СНз, С1, СОСНз); N-заместители влияют на спектр незначительно. Производные фенотиазина имеют максимум поглощения при 510—530 ммк.

Street изучил спектры 5 производных фенотиазина в 0, 1 н. и 50% растворах серной кислоты. Использование спектрофотометрии и метода экстракции Dubost и Pascal позволило выделить от 59 до 72% добавленного к крови флупромазина и идентифицировать это соединение. Экспериментальные данные подтверждены анализами мочи людей, получавших флупромазин.

Ferrari и Foth использовали тонкослойную хроматографию на силикагеле-g для выделения хлорпромазина, его метаболитов и родственных психотропных средств из мочи. Лучшей системой растворителей для восходящих хроматограмм (при 26—27°) является н-футанол — уксусная кислота — вода в соотношении 88: 5: 7 для хлорпромазина и хлорпротиксена и 65: 15: 20 для амитриптилина и имипрамина. Проявление проводили распылением концентрированной серной кислоты. Хлорпромазин и его метаболиты проявлялись в виде пятен от красной до фиолетовой окраски; имипрамин и его метаболиты давали зеленую, а амитриптилин кирпично-красную флуоресценцию при 250 ммк после нагревания (95—100°). Cochin и Dale использовали тонкослойную хроматографию для идентификации фенотиазиновых транквилизаторов  и антигистаминных препаратов в жидкостях и тканях человека без выделения их или с использованием предварительной очистки. Кровь и мочу экстрагировали при pH 9, 0 дихлорэтаном, содержащим 10% изоамилового алкоголя. Остаток после упаривания растворителя растворяли в этаноле и наносили на хроматографическую пластинку. Системы растворителей:     бензол—диоксан—водный аммиак (60: 35: 5), метанол — бутанол (60: 40), бензол — диоксан — водный аммиак (10: 80: 10). В качестве проявителей применяли 50% раствор серной кислоты в этаноле в соотношении 4: 1 и йодплатиновый реагент (к 10 мл 10% раствора хлорида платины добавляли 250 мл 4% раствора йодида калия и объем раствора доводили водой до 500 мл). 8. М. Светлаева и С.В. Журавлев применили тонкослойную хроматографию для анализа этаперазина и промежуточных веществ и хроматографию трифтазина на незакрепленном слое окиси алюминия. Т.И. Буленков также использовал хроматографию на незакрепленном слое окиси алюминия для анализа 9 производных фенотиазина.

Marigo приводит классификацию психотропных средств и данные их хроматографического анализа.

Fluang с соавторами, применив восходящую хроматографию на бумаге сконцентрированной пробы мочи в системе растворителей этанол — бутанол — вода (2: 5: 2) и предварительный гидролиз мочи с помощью ?-глюкуронидазы в течение 24 часов при pH 7°, и температуре 37°, определили у 7 хронических шизофреников, получавших ежедневно от 300 до 1200 мг торазина (аминазина), как неизмененный препарат, так и 3 его метаболита; в среднем 58% торазина выделяется в виде метаболита. Для опрыскивания хроматограмм применяли 50% раствор серной кислоты и 1% раствор хлорида окисного железа. Окрашенные зоны вырезали, мацерировали в 50% растворе серной кислоты, оптическую плотность определяли на фотометре. Инфракрасный спектр показал пики от 2, 7 до 2, 85 мк, характерные для фенольных метаболитов. Walkenstein и Seifter применили бумажную хроматографию при исследовании мочи крыс и собак, получавших хлорпромазин. В качестве проявителей •использовали ультрафиолетовое облучение, 2% раствор нитропруссида натрия в ацетальдегиде, а затем — после полного высыхания бумаги — 2% раствор карбоната натрия (специфично для вторичных аминов), 0, 5% раствор мышьякового ангидрида в концентрированной соляной кислоте и 0, 1% раствор нитрата кобальта. Идентифицировано 3 метаболита промазина (монометилпромазин, промазинсульфоксид и монометилпромазинсульфоксид). Для качественного и ориентировочного количественного определения фенотиазинов Fleyman и Bayne использовали бумагу, импрегнированную раствором нитрата уранила или нитрата ртути г последующей обработкой персульфатом аммония и перекисью водорода; при этом в случае наличия фенотиазинов появлялось красное или красно-коричневое окрашивание.

Для определения в моче метоксипромазина Allgen с соавторами применили бумажную хроматографию. Мочу извлекали эфиром. Хроматограммы развивались в 2 системах растворителей: бутанол — уксусная кислота — вода и бутанол — лимонная кислота — вода. После элюирования пятен 0, 1 н. раствором серной кислоты и ультрафиолетовой спектрофотометрии показано, что 1/3 метоксипромазина выделяется с мочой (в основном в форме сульфоксида). Wechsler и Forrest разработали метаболитов в печени и мозгу крыс. Для экстракции они применили смесь н-гептана, метаболитов в печени и мозгу крыс. Для экстракции они применили смесь н-гептана, содержащего 1, 5% раствор изоамилового спирта. Хлорпромазин и его метаболиты экстрагируют из щелочной среды, переводят в сульфоксид с помощью ледяной уксусной кислоты и затем определяют на спектрофотометре Бекмана; при этом хлорпромазин сульфоксид имеет максимум от 300 до 340 ммк. Для обнаружения хлорпромазина и его метаболитов авторы использовали концентрированные серную и соляную кислоты и смесь из 80 мл 10% раствора серной кислоты с 20 мл 5% раствора хлорида окисного железа. Отмечено, что хлорпромазин сульфон не образует окрашивания с примененными реактивами.

Anders и Mahnering предложили газовую хроматографию для 20 производных фенотиазина.

Street использовал обращенно-фазовую бумажную хроматографию для анализа 8 фенотиазинов и имипрамина при 95°. В качестве проявителей применяли модифицированный реактив Марки и йодплатиновый реагент.

Т.Н. Буленков и Г.А. Старкова разработали фотоколориметрическое определение 5 фенотиазиновых производных в таблетках, видоизменив методику, предложенную Overholser и Joe.

Р.М. Пиняжко и Н.М. Туркевич исследовали ультрафиолетовые спектры поглощения фенотиазинов и родственных соединений.

Clarke предложил микрохимическую идентификацию 50 антигистаминных препаратов. Для хлорпромазина он применял реакции окрашивания с реактивом Марки, молибдатом аммония, двуокисью селена и другие реакции. Он же разработал микрокристаллические реакции на хлорпромазин с 5% раствором хлорида и бромида золота.

Kirk наиболее детально и последовательно исследовал 50 производных фенотиазина и других родственных соединений. Он привел реакции окрашивания с 10 реактивами и данные микрокристаллоскопического и опектрофотометрического исследований чистых препаратов.

Метаболизм соединений фенотиазинового ряда освещен во многих работах, в частности в обзоре Emmerson и М1уа, охватывающем литературу до 1962 г.

Распределение и сохраняемость производных фенотиазина в биологическом материале изучены недостаточно. Наиболее интересна работа Forrest с соавторами о распределении хлорпромазина в тканях больного, умершего после длительного лечения этим препаратом. Содержание хлорпромазина в 1 г ткани легких составляло 98 мкг, аппендикса — 29 мкг. гонад—17, 48 мкг, печени—13, 5 мкг, надпочечников — 11, 3 мкг, кишечника — 3. 2 мкг на 1 г влажного веса; в ткани мозга — от 1, 5 до 12 мкг/г. Костная ткань жир не содержали хлорпромазин, волосы содержали максимальное количество его (124 мкг/г), ногти — 37 мкг/г.

Выводы

1. Методы определения аминазина и его метаболитов для судебнохимического исследования трупного материала не разработаны.
2. Недостаточно полно разработаны методы изолирования производных фенотиазина и их метаболитов из биологического материала, не изучены оптимальные условия экстрагирования.
3. Не разработаны применительно к судебнохимическим исследованиям микрокристаллические реакции обнаружения аминазина и его аналогов. Дифференцирование этих соединений реакциями окрашивания вследствие его неспецифичности недостоверно.
4. Отсутствуют точные и сопоставимые данные о сохраняемости производных фенотиазина и их метаболитов при гниении.