Изолирование, обнаружение и определение хлорофоса при исследовании трупного материала

В связи со все более широким распространением хлорофоса отмечаются случаи смертельных отравлений. Тем не менее судебнохимические доказательства отравления хлорофосом разработаны недостаточно. Так, в доступной нам литературе имеются данные лишь о методах определения хлорофоса в его препаратах, растительном материале и воздухе.

Целью настоящей работы явилось изучение методов изолирования хлорофоса из трупного материала, установление границ его обнаружения и определения, получение данных относительно сохраняемости его в трупном материале и распределения во внутренних органах трупа.

Экспериментальная часть

Изучение методов изолирования хлорофоса

К 100 г измельченной печени добавляли 20—100 мг хлорофоса и тщательно перемешивали. Через 24 часа проводили извлечение одним из растворителей: подкисленной водой, подкисленным спиртом, хлороформом и ацетоном (в первых 2 случаях пользовались методами, описанными М.Д. Швайковой).

Извлечение хлороформом с некоторыми изменениями проводили по методу Н.А. Горбачевой, примененному в отношении антабуса. К объекту добавляли 5 г хлорида натрия, стеклянные бусы и проводили 3-кратное извлечение 50-миллиметровыми порциями хлороформа в течение 2 часов. Извлечения фильтровали и оставляли для испарения растворителя. Остаток растворяли в 50 мл дистиллированной воды и фильтровали. Фильтрат извлекали хлороформом (4 раза по 15 мл). Объединенные хлороформные извлечения фильтровали в чашку Петри и оставляли для испарения хлороформа. Извлечение ацетоном проводили по следующей схеме: к объекту добавляли 200 мл ацетона и оставляли на 2 часа при частом перемешивании. Жидкость сливали и фильтровали. Настаивание проводили еще дважды: каждый раз в течение 1 часа со 100 мл ацетона. Извлечения объединяли и выпаривали при 40° до объема 30—50 мл, после чего к остатку прибавляли 100 мл воды и фильтровали. Фильтрат извлекали хлороформом (4 раза по 20 мл). Объединенные хлороформные извлечения фильтровали в чашку Петри и оставляли при комнатной температуре для испарения.

В остатках, получаемых при помощи всех 4 методов изолирования под микроскопом наблюдали игольчатые кристаллы или их сростки. Растворы этих остатков в точном объеме дистиллированной воды исследовали качественно и количественно.

Качественное исследование

• а) К 1 мл исследуемого раствора прибавляли 2—3 капли 1 % раствора резорцина в 1% растворе едкого натра. Через 10—30 мин. возникало розовое или красное окрашивание и желтовато-зеленая флюоресценция (0, 04 мг и более хлорофоса в пробе) или желтое окрашивание и такая же флюоресценция (0, 05—0, 04 мг).
• б) К 1 мл исследуемого раствора добавляли 1 мл 0, 5% раствора о-толидина (или основного бензидина) в ацетоне и 1 мл смеси 3% раствора перекиси водорода с 0, 5% раствором едкого натра в соотношении 2:3, при этом тотчас же возникало желтое или оранжево-красное окрашивание.
• в) В 2 фарфоровые чашечки вносили по капле фосфатного буфера (pH 7, 0) и индикаторной смеси (5 частей плазмы трупной крови, 15 частей воды, 0, 5 части 0, 1 н. раствора едкого натра и 1, 25 части 0,6% раствора бром-тимолового синего в 0, 1 н. растворе едкого натра). К одной из этих жидкостей прибавляли каплю исследуемого раствора. Через 10 мин. к обеим жидкостям добавляли по капле 0, 4% раствора ацетилхолина. Через 15—30 мин. наблюдался постепенный переход синей окраски в желтую в той смеси, к которой исследуемый раствор не добавляли.
• г) К 1 мл исследуемого раствора прибавляли 0, 5 мл 25% серной кислоты и 0, 5 мл 0, 01 н. раствора перманганата калия. Параллельно ставили контрольный опыт с 1 мл дистиллированной воды теми же реактивами и в тех же количествах. В течение 20 мин. окраска в обоих опытах не изменялась. Обесцвечивание раствора перманганата калия может указать на присутствие продуктов распада хлорофоса—0,0-диметил-2,2-дихлорвинил-фосфата и 2,2-дихлорвинил-фосфата, дающих аналогичные реакции с хлорофосом. Чувствительность реакции с перманганатом калия для первого из указанных веществ следующая: открываемый минимум — 0,15 мг, предельное разбавление— 1:67000.

Таким образом, положительные результаты 3 первых реакций и отрицательный результат 4-й указывают на присутствие хлорофоса, положительные результаты всех 4 реакций — на присутствие хлорофоса и продуктов его распада.

Количественное определение

В пробирку емкостью 50 мл вносили 1 мл исследуемого раствора, 0, 7 мл концентрированной серной кислоты и 10 капель 57% хлорной кислоты и нагревали на электроплитке с асбестовой сеткой. Через 10—15 мин. смесь темнела, затем обесцвечивалась, принимала зеленовато-желтый цвет; выделялись обильные белые пары. При продолжении нагревания окрашивание и пары исчезали; в этот момент нагревание прекращали. После охлаждения смесь при помощи 35 мл дистиллированной воды переносили в мерную колбу емкостью 50 мл, последовательно прибавляли по 2 мл 1% раствора молибдата аммония и 1% раствора аскорбиновой кислоты, перемешивали и помещали на 15 мин. в кипящую водяную баню. После охлаждения объем окрасившейся в синий цвет жидкости доводили до метки дистиллированной водой, перемешивали, наливали в кювету с рабочей длиной 20 мм, определяли оптическую плотность при красном светофильтре (680 ммк). Для сравнения служила смесь реагентов, разбавленная водой до 50 мл. По калибровочной кривой находили содержание хлорофоса. Калибровочную кривую приготовляли в пределах 0, 05—0, 5 мг с интервалом 0, 05 мг аналогичным образом, используя для этого 0,01% стандартный раствор химически чистого хлорофоса, полученного путем многократной перекристаллизации из воды технического хлорофоса до получения препарата с содержанием чистого вещества 98, 5%. Для изучения эффективности изолирования хлорофоса перегонкой с водяным паром поставили опыты по методу, разработанному Бакинской судебномедицинской лабораторией. К 100 г измельченной печени добавляли 100 мг хлорофоса и через 24 часа перегоняли с водяным паром до получения 200 мл отгона. Последний исследовали реакцией с раствором резорцина в щелочной среде, раствором азотнокислого серебра и реакцией образования изонитрила как непосредственно, так и после извлечения эфиром. В 8 из 10 опытов получены отрицательные результаты.

Во всех контрольных опытах с печенью (без добавления хлорофоса) получены отрицательные результаты, за исключением опытов с ацетоном и хлороформом, извлечения которых в отдельных случаях давали положительную реакцию на фосфор. Результаты изолирования хлорофоса представлены в табл. 1.

Таблица 1

Сравнительная оценка различных методов изолирования хлорофоса из трупного материала

Как видно из табл. 1, наибольшее количество хлорофоса изолируется ацетоном (20,7%) и хлороформом (13, 71%). Однако в этих случаях извлечения были значительно загрязнены балластными веществами, что могло отразиться на результатах количественного определения (положительная реакция на фосфор в отдельных контрольных опытах). Попытки очистить извлечения при помощи силикогеля и окиси алюминия, покрытой полиэтиленом, к желаемым результатам не привели. Поэтому мы решили более детально изучить метод извлечения подкисленной водой, дающий чистые остатки и отрицательные результаты всех контрольных опытов. Представляло также интерес изучение возможности открытия хлорофоса по систематическому ходу анализа (в кислом извлечении).

Изучение метода извлечения подкисленной водой

а) Влияние кратности настаивания. Поставили ряд опытов по извлечению хлорофоса, добавленного к печени (от 20 до 100 мг, выдерживание 24 часа), с однократным настаиванием с подкисленной водой (200 мл) в течение 2 часов и с 3-кратным настаиванием в течение 1—2 часов (со 150 мл воды), 2 и 3 часов (с 75 мл воды). Жидкости процеживали через марлевый тампон, отделяли центрифугированием и извлекали 5 раз хлороформом (30 мл). Хлороформную эмульсию, если она возникала, разрушали центрифугированием. Остатки при испарении хлороформа при комнатной температуре исследовали качественно и количественно по описанной выше методике. Результаты показаны в табл. 2.

Таблица 2

Влияние кратности настаивания на процесс изолирования подкисленной водой

Таким образом, при 3-кратном настаивании извлекается в среднем 11, 56% хлорофоса, при однократном — 9,1%. В контрольных опытах получены отрицательные результаты.

б) Влияние pH среды Поставлены опыты с подкислением объектов (после заливания водой) 10% раствором серной кислоты до pH 2, 0, насыщенным раствором щавелевой кислоты до pH 3,5—4, 0 и с добавлением 25% раствора аммиака до pH 7,0—7,5. Исследовать влияние резко щелочной среды было нецелесообразно ввиду неустойчивости хлорофоса уже при pH 7, 0 (изолировали по варианту с 3-кратным настаиванием). Результаты опытов представлены в табл. 3.

Эти данные свидетельствуют о том, что в пределах pH 2, 0—4, 0 количество изолированного хлорофоса находится приблизительно на одном уровне, а при pH 7, 0—7, 5 несколько снижается.

Установление границ обнаружения и определения хлорофоса в трупном материале

Были поставлены опыты с 5, 2, 5, 1 и 0,5 мг хлорофоса, добавленными к 100 г печени. Изолировали подкисленным спиртом (с целью изучения возможности этой методики) и подкисленной водой (вариант с 3-кратным настаиванием). Обнаружение и определение извлеченного хлорофоса проводили по описанной выше методике. Результаты показаны в табл. 4.

Таблица 3

Влияние pH среды на процесс извлечения хлорофоса

Таблица 4

Установление границ обнаружения и определения хлорофоса, добавленного к трупному материалу

Из приведенных данных следует, что граница обнаружения хлорофоса при извлечении подкисленным спиртом и водой составляет 1 мг, граница определения — 2, 5 мг.

Методика исследования трупного материала на хлорофос

а) Изолирование. К 100 г измельченного материала добавляли 150 мл дистиллированной воды, подкисляли 10% раствором серной кислоты до pH 2, 0—2, 5, оставляли на 2 часа при частом перемешивании, процеживали через марлевый тампон, а объект заливали еще дважды 75 мл дистиллированной воды с последующим подкислением серной кислотой и настаиванием в течение часа. Объединенные водные жидкости центрифугировали и извлекали хлороформом 5 раз по 30 мл. Образовавшуюся эмульсию разрушали центрифугированием. Хлороформные извлечения объединяли и оставляли при комнатной температуре для испарения растворителя. Остаток рассматривали под микроскопом. При наличии 5 мг и более хлорофоса наблюдали бесцветные игольчатые кристаллы, чаще всего собранные в радиально расходящиеся сростки. Остаток растворяли в 5 мл дистиллированной воды; раствор фильтровали в пикнометре емкостью 5 мл и доводили водой до метки.

б) Обнаружение и определение хлорофоса проводили, как описано выше. Для этого при желтом окрашивании о-толидиновой пробы брали 1 мл исследуемого раствора, при оранжевом — 1 мл исследуемого раствора в разведении 1:10, при темно-оранжевом — 1 мл в разведении 1:100.

Сохраняемость хлорофоса при гниении трупного материала

Исследования проводили с печенью, желудком и кишечником с их содержимым. К 100 г измельченных органов добавляли по 30—50 мг хлорофоса и через 2, 8, 12 и 15 дней исследовали по разработанной нами методике. Навески хранили при 20—25°. Через 8 дней объекты приобретали резкий гнилостный запах и зеленовато-желтую окраску. Через 12—15 дней эти явления были еще более выражены. В каждой труппе 2 из 6 опытов были контрольными. Результаты сведены в табл. 5.

Из приведенных данных следует, что хлорофос может быть не найден: в печени — после 10 дней гниения, в желудке и кишечнике — после 12 дней. В контрольных опытах получены отрицательные результаты.

Опыты на животных

Для определения, какие органы следует исследовать на хлорофос, были проведены опыты на кроликах. При этом один кролик, получив через рот хлорофос в дозе 800 мг/кг, погиб через 50 мин.; 2 других получали по 400 мг/кг, их забивали через 1 час. Внутренние органы исследовали по разработанной методике. Результаты приведены в табл. 6.

Наибольшие количества хлорофоса в расчете на 100 г органа обнаруживали в желудке, тонком кишечнике, печени, почке и моче.

Выводы

1. При исследовании трупного материала на хлорофос наиболее приемлем в практике метод изолирования подкисленной водой, который дает чистые остатки и значительно сокращает время исследования.

Таблица 5

Сохраняемость хлорофоса в трупном материале

Таблица 6

Результаты опытов на животных

2. Положительные результаты о-толидиновой, резорциновой и холинэстеразной проб и отрицательный результат реакции с перманганатом калия указывают на присутствие хлорофоса и продуктов его распада — 0,0-диметил-2,2-дихлорвинил-фосфата и 2,2-дихлорвинил-фосфата. Граница обнаружения хлорофоса по разработанной нами методике составляет 1 мг.

3. Хороший результат дает колориметрическое определение хлорофоса. Граница обнаружения по этому методу 2, 5 мг.

4. Опытами на кроликах установлено, что наибольшее количество хлорофоса определяется в желудке, тонком кишечнике, почке, моче, печени и меньше — в мозгу, легких, мышцах сердца и селезенке.

5. Хлорофос некоторое время сохраняется в загнивших органах. В печени он может быть изолирован, обнаружен и определен до 12 дней, в желудке и кишечнике — до 15 дней.