К вопросу хроматографического выделения морфина при судебнохимическом исследовании трупного материала

Исследование трупного материала на морфин до настоящего времени остается частой, но трудной экспертизой.

Одной из трудностей доказательства наличия морфина при судебнохимических исследованиях является несовершенство применяемых методов его изолирования. Установлено, что в процессе изолирования теряется до 98% морфина и удается обнаруживать лишь не менее 15—25 мг его в анализируемой навеске органов.

В целях уменьшения потерь морфина при судебнохимическом исследовании трупного материала мы попытались применить для его выделения ионообменные смолы. В основу работы положены детальные исследования Н.А. Измайлова с сотрудниками по изучению сорбционного метода получения морфина из растительного сырья. В связи с применением этого метода для совершенно других, стоявших перед нами задач аналитического порядка, внесены изменения в его технику, для чего на водных растворах морфина эмпирически отработаны отдельные вопросы методики.

Вместо рекомендованной для технологических целей конденсационной смолы КУ-1 мы применяли полимеризационные смолы КУ-2 (с набухаемостью 110 отн. %) и СДВ-3 (с набухаемостью 260 отн. %), которые для наших аналитических целей оказались более эффективными. Использованные образцы смол СДВ-3 и КУ-2 при хорошей адсорбирующей способности по отношению к морфину выгодно отличаются от смолы КУ-1 большей механической прочностью и химической устойчивостью вообще и в частности к раствору аммиака, которым элюировался морфин с колонки. Кроме того, указанный образец катионита СДВ-3 имеет преимущество в десорбционных свойствах. Проведенные опыты показали, что вытеснение одного и того же количества морфина с катионита СДВ-3 происходит меньшим почти в 2 раза объемом аммиака, чем с КУ-1 ¹ и КУ-2, что имеет существенное значение в анализе, так как элюат получается в 2 раза более концентрированным по отношению к морфину и время исследования сокращается. Образцы смолы КУ-2 с большей набухаемостью, которые, подобно СДВ-3, могут обладать лучшей десорбционной способностью по отношению к: морфину, мы практически не проверяли вследствие заметного разрушения их в растворе аммиака. Это тем более относится к смоле КУ-1, которая уже при набухаемости 160 отн. % сильно загрязняла элюаты продуктами распада смолы в растворе аммиака и поэтому в дальнейшей работе не применялась.

Для полной сорбции морфина катионитом из растворов необходима максимальная ионизация солей морфина при минимальном содержании ионов водорода. Это достигается, как показал Н.А. Измайлов с сотрудниками, при pH 5,0—6,0, которое является оптимальным для выделения морфина на катионите. В наших опытах при pH 5,0—6,0 производилась не только сорбция морфина на ионите, но и изолирование его водой из трупного материала.

Эмпирически установлено, что 2, 5 г использованного нами образца катионита СДВ-3 и 5 г КУ-2 вполне достаточно для сорбции морфина в количестве до 100 мг ².

Элюирование адсорбированного на колонке морфина производилось 5% водным раствором аммиака. Установлено, что для десорбции количества морфина, не превышающего 100 мг, с катионита СДВ-3 практически достаточно 60 мл, с катионита КУ-2—100 мл элюента. Если учесть, что при судебнохимическом исследовании 100 г трупного материала получается около 250 мл водного извлечения, то, следовательно, происходит концентрирование раствора морфина на катионите СДВ-3 в 4, на КУ-2 в 2,5 раза.

Экспериментальная проверка и отработка методики показали возможность использования ее для выделения морфина при исследовании трупного материала.

Опыты с трупным материалом ставили по следующей методике. 100 г печени трупов людей смешивали с определенным количеством морфина. Через 17—20 часов объект заливали 200 мл дистиллированной воды, подкисляли раствором щавелевой кислоты до pH 5, 0—6, 0, настаивали в течение 2 часов при периодическом взбалтывании, после чего жидкость фильтровали и фильтрат пропускали через предварительно подготовленную колонку катионита в Н-форме со скоростью не более 2 капель в секунду.

Подготовка колонки к анализу. В течение суток выдерживают в 1% растворе соляной кислоты 2,5 г катионита СДВ-3 фракции не менее 0,5 мм или 5 г КУ-2 той же фракции для набухания и переведения их в Н-форму. Набухший катионит с помощью дистиллированной воды, не допуская образования воздушных камер, переносят в хроматографическую колонку (стеклянную трубку с оттянутым концом с одной стороны и воронкообразным расширением — с другой; высота трубки 16—17 см, диаметр 1,5—1,7 см), отверстие которой предварительно закрывают тампоном из стеклянной ваты. На оттянутый конец колонки надевают резиновую трубку с пипеткой. Скорость истечения раствора из колонки регулируют винтовым зажимом. Для освобождения от избытка соляной кислоты катионит промывают дистиллированной водой до pH фильтрата, равного 5,0—6,0 (по метиловому красному). Подготовленную таким образом колонку катионита в Н-форме используют для анализа.

При пропускании извлечения через колонку основная масса белков и других примесей проходила в фильтрат. Однако частично они сорбировались катионитом вместе с морфином. Для вытеснения молекулярно сорбированных балластных веществ через колонку с большой скоростью (потоком) пропускали дистиллированную воду до исчезновения окрашивания и мути в фильтрате (приблизительно 60 мл), после чего морфин с колонки элюировали 5% водным раствором аммиака. Элюат исследовали на морфин, а колонку катионита после регенерации ³ вновь использовали в анализе.

Для обнаружения морфина применяли общепризнанные реакции окрашивания с реактивами Фреде и Марки, а также микрокристаллические реакции с реактивами Марме и Несслера, изученными по отношению к морфину Леви и Фармило.

Реакцию окрашивания с реактивами Марки (формалинсерной кислотой) и Фреде (концентрированной серной кислотой, содержащей молибденовую кислоту) проводили по общепринятой методике. Чувствительность реакции с реактивом Марки составляет 0,3γ, реакции с реактивом Фреде - 0,1γ морфина.

На чувствительность микрокристаллической реакции с реактивом Марме оказывает влияние концентрация йодида калия в реактиве и соотношение объемов испытуемого раствора и реактива.

Сухой остаток, содержащий морфин, растворяли в 3 каплях 1% раствора соляной кислоты и прибавляли 1 каплю ⁴ реактива Марме ⁵. При этом образуется нерастворимый комплекс — (C₁₇H₁₉O₃N), (CdJ₂) в виде аморфного осадка, который через 1—5 минут кристаллизуется с образованием тонких нежных сильно удлиненных игл (рис. 1). Кристаллизация начинается с краев капли. Чувствительность реакции — 1,87γ морфина.

Микрокристаллическая реакция с реактивом Несслера. Сухой остаток морфина растворяли в капле 1 % раствора соляной кислоты и к раствору прибавляли каплю реактива Несслера ⁶. Образовывался аморфный осадок комплексного соединения — (C₁₇H₁₉O₃NH) (HgJ₃), кристаллизующийся при стоянии. При исследовании осадка под микроскопом наблюдались удлиненные иглы и нити (рис. 2). Чувствительность реакции — 2,2γ морфина.

Рис. 1. Кристаллы комплекса морфина с реактивом Марме.

Для обнаружения морфина вышеописанными реакциями в аммиачном элюате последний, во всех случаях необходимо подвергать дополнительной очистке, так как балластные вещества в тех сравнительно небольших количествах, которые десорбируются вместе с морфином, заметно маскируют его в реакциях. Для очистки аммичный элюат частично упаривали на водяной бане и при pH 9, 0—10, 0 четырехкратно извлекали хлороформом. При этом стойких эмульсий не образовывалось. Хлороформное извлечение выпаривали досуха при комнатной температуре или при нагревании на водяной бане. Примерно половину полученного остатка растворяли в нескольких каплях безводного метилового или этилового спирта ⁷ распределяли на 2 часовых стекла и проверяли на наличие морфина микрокристаллическими реакциями.

Вторую половину остатка прямо в чашке исследовали реактивами Фреде и Марки.

Результаты опытов представлены в таблице.

Полученные результаты показывают, что надежную границу обнаружения морфина реакциями окрашивания при применении смолы СДВ-3 составляют 2 мг его в 100 г печени.

Таким образом, применение ионного обмена на катионите СДВ-3 для очистки и концентрирования извлечения из биологического материала позволило повысить чувствительность его обнаружения в 7,5 раз по сравнению с обычным методом его изолирования подкисленной водой и в 12,5 раз по сравнению с извлечением подкисленным спиртом.

Важно отметить, что после хроматографического выделения с последующей очисткой морфин получается в достаточно чистом виде, благодаря чему результаты реакций окрашивания становятся более наглядными и убедительными.

Чувствительность обнаружения морфина теми же реакциями при применении КУ-2 с набухаемостью 100 отн. % (см. таблицу) примерно в 2,5 раза ниже, чем при СДВ-3, но в 3—5 раз выше, чем при обычных методах извлечения подкисленными водой и спиртом. Следовательно, для хроматографического выделения морфина выгоднее применять катионит СДВ-3 с набухаемостью 260 отн. %.

Микрокристаллические реакции, хорошо воспроизводимые на водных растворах, при исследовании извлечений из трупного материала, как видно из таблицы, не дают стабильных результатов. Считаем, что применение микрокристаллических реакций в исследовании трупного материала не является излишним. Однако судебнохимическое значение

Рис. 2. Кристаллы комплекса морфина с реактивом Несслера.

Обнаружение морфина в трупном материале после хроматографического выделения

Условные обозначения: ++ резко положительная реакция, + положительная, +— слабо положительная, — отрицательная, н/п не проводилась.

следует придавать только их положительным результатам. Основное же, решающее значение для доказательства наличия морфина в биологическом материале принадлежит реакциям Фреде и Марки.

Изложенная методика проверена на сильно загнившем трупном материале: навески печени измельчали, смешивали с 5, 10 или 15 мг морфина и хранили при комнатной температуре от 10 до 40 дней. Во всех поставленных 22 пробах морфин надежно обнаруживался реакциями окрашивания. Результаты микрокристаллических реакций были переменными.

Каждую серию опытов со свежим и загнившим трупным материалом постоянно сопровождали постановкой «холостых» проб. При исследовании последних ни в одном случае не наблюдалось окрашивания или выделения кристаллов, характерных для описанных реакций.

Данное сообщение включает лишь качественную характеристику метода. Количественное определение морфина после хроматографического его выделения является предметом дальнейшего изучения.

Выводы

1. Для выделения морфина при судебнохимическом исследовании трупного материала использованы катиониты СДВ-3 и КУ-2.
2. Показано, что ионный обмен на катионите благодаря концентрированию и очистке извлечений от балластных веществ позволяет повысить чувствительность обнаружения морфина в трупном материале. Применение катионита СДВ-3 увеличивает чувствительность в 7,5—12,5, а катионита КУ-2 — в 3—5 раз по сравнению с обычно принятыми методами извлечения морфина соответственно подкисленными водой или спиртом. Для выделения морфина предпочтительнее применять смолу СДВ-3.

¹ Использованная в наших опытах смола имела набухаемость 160 отн. %.

² Количество морфина более 100 мг в пробе трупного материала вряд ли может иметь значение в практике судебнохимического анализа и поэтому в нашей работе не проверялось.

³ Регенерацию использованного катионита производили путем пропускания через колонку со скоростью 2—3 капли в секунду последовательно 40 мл 5% раствора аммиака, 80 мл 5% водного раствора едкого натра, 40 мл воды и 130—150 мл 5% раствора соляной кислоты с последующим промыванием колонки дистиллированной водой по метиловому красному (до pH фильтрата, равного 5, 0—6, 0).

⁴ Объемы капель соляной кислоты и реактива Марме должны быть по возможности одинаковы.

⁵ Реактив Марме — 0, 2 М водный раствор K₂CdlI₄, содержащий избыток йодида калия в количестве 0,4 М.

⁶ Состав реактива Несслера: йодида ртути (II) — 4,545 г, йодида калия — 3,320 г, воды — 50 мл.

⁷ Применение с этой целью хлороформа по-причине плохой: растворимости в нем морфина не рекомендуется.