Иммунная хроматография как предварительный метод химико-токсикологического анализа. Анализ ложноположительных результатов

Согласно действующим на данный момент приказам МЗ РФ (№ 933н от 18 декабря 2015 г. и № 40 от 27 января 2006 г.), а также ведомственным приказам, проведение химико-токсикологического исследования пробы биологического объекта (мочи) должно осуществляться в два этапа:
1) предварительные исследования иммунохимическими методами;
2) подтверждающие исследования методами газовой и (или) жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием с помощью технических средств, обеспечивающих регистрацию и обработку результатов исследования путем сравнения полученного результата с данными электронных библиотек масс-спектров.

Химико-токсикологические исследования крови проводятся в один этап подтверждающими методами исследования. По окончании первого этапа, в случае положительного результата, проводится второй этап химико-токсикологического исследования подтверждающими методами.

При обнаружении в ходе подтверждающих исследований в пробе биологического объекта (мочи, крови) наркотических средств, психотропных веществ, новых потенциально опасных психоактивных веществ, химических веществ, в том числе лекарственных препаратов, выносится заключение об обнаружении в биологическом объекте (моче, крови) вызывающих опьянение средств (веществ) с указанием выявленного средства (вещества). При получении по результатам подтверждающих исследований пробы биологического объекта (мочи, крови) отрицательного результата выносится заключение об отсутствии в исследованной пробе биологического объекта (моче, крови) вызывающих опьянение средств (веществ).

На первом этапе – предварительные исследования – используются методы иммунохимии, в частности иммунохроматографический анализ (ИХА).

Скрининг-тесты, используемые для анализа наркотических и психотропных веществ в биологических жидкостях, являются высокочувствительными. Но они не отличаются высокой специфичностью и часто вообще не специфичны. Особенность этого метода в том, что нет необходимости проводить изолирование веществ из объектов и применять специальные приемы по их очистке. Кроме того, он не требует дорогостоящего оборудования, достаточно быстр, может проводиться вне химико-токсикологической лаборатории.

В основе иммунных методов лежит взаимодействие специфических антител (антисывороток) с анализируемым веществом, выступающим в роли антигена (гаптена).

Положительный результат, полученный данным методом, может обозначать, что обследуемый принимал наркотик: а) постоянно, б) нерегулярно, в) по рецепту врача или самостоятельно; или что предварительные методы обнаружения недостаточно надежны. Ложноположительные результаты (а их может быть, по литературным данным, до 10–15 %) обусловлены недостаточной специфичностью метода за счет перекрестных реакций, слабой профессиональной подготовки, систематической ошибки.

Общей проблемой для всех иммунных методов является кросс-реактивность. Поскольку антитела формируют места связывания не на конкретную молекулу, а на некоторый характерный фрагмент молекулы, то и иммунная реакция может происходить с веществами, имеющими в своей структуре этот фрагмент. Наличие перекрестных реакций с другими соединениями может стать причиной ложноположительных реакций.

Поскольку ферменты – белковые катализаторы биохимических реакций – нестабильны, это может сказываться на результатах анализа. На активность ферментов влияют многие факторы, как следствие, возможны ложноположительные и ложноотрицательные результаты ИФА. В первую очередь их вызывают химические ингибиторы ферментов, антикоагулянты, некоторые лекарственные вещества или метаболиты лекарственных веществ, метаболиты ядовитых соединений, продукты распада белковых молекул (тирамин, фенилпропаноламин), загрязнение микроорганизмами. Специфичность реакции может быть снижена присутствием ревматоидного фактора, который дает положительную реакцию в отсутствии исследуемых антител.

Биологические жидкости, используемые для анализа, могут оказывать влияние на активность фермента метки за счет солевого состава, изменяющего значение рН и ионную силу анализируемого образца. Ферменты, как и все белки, меняют активность под действием таких факторов, как нагревание, разведение образцов, изменение рН, присутствие солей тяжелых металлов, антикоагулянтов, микроорганизмов.

Кроме того, возможна реакция и с другими химическими соединениями, не принадлежащими к исследуемой группе лекарств (наркотиков). Например, ложноположительный результат может дать тест-полоска на каннабиноиды (по данным литературы), если в образце мочи в относительно большом количестве содержится папаверин с дибазолом, например, лекарственный препарат папазол.

Методу придается значение при отрицательном результате. Если анализ дает положительный результат, данные подтверждаются другими методами и реакциями.

В нашем центре проводятся химико-токсикологические исследования мочи военнослужащих, заключающих контракты, выезжающих в «горячие точки», по плановым и внезапным проверкам, доставленным военной полицией, при подозрении на употребление наркотических или психотропных веществ и т.п. В ряде случаев первичный этап (предварительное исследование с помощью тест-полосок) проводится в медицинских частях и госпиталях. На второй этап (подтверждающие методы) доставляются пробы с положительным результатом и, выборочно, с отрицательным – для исключения ложноотрицательных результатов.

В частях ВВО используются тест-системы «Наркостоп» МУЛЬТИ-6 (производство Гуаньджоу Вондфо Биотек Ко., Лтд., КНР) для выявления каннабиноидов, опиатов, амфетамина, метамфетамина, МДМА, метадона. В нашем отделении используются также тест-полоски отечественного производства (ООО «ФакторМед»), как индивидуальные, так и в наборах, для выявления каннабиноидов, опиатов, кокаина, амфетамина, метамфетамина, МДМА, метадона, фенциклидина, барбитуратов и ТАД (амитриптилина/нортриптилина). В качестве подтверждающего метода используется метод газовой хроматографии – масс-спектрометрии (ГХ-МС).

Наиболее часто в нашей практике встречаются положительные и ложноположительные результаты на каннабиноиды.

Для подтверждающего анализа на каннабиноиды проводятся щелочной гидролиз, очистка гидролизата, экстракция из кислой среды и дериватизация метилиодидом в щелочной среде.

За последние два года, в связи с применением тестов производства Гуаньджоу, увеличилось количество ложноположительных результатов. Был проведен параллельный анализ проб тестами производства Фактор-Мед с последующим ГХ-МС-анализом.

С помощью тест-системы «Наркостоп» было получено 129 положительных результатов на наличие в моче каннабиноидов. При дополнительном исследовании полосками ИХА-Марихуана-Фактор и подтверждающем исследовании методом ГХ-МС были получены следующие результаты:

• в 88 пробах, положительных при исследовании тест-полоской ИХАФактор, методом ГХ-МС выявлена ТГК-кислота;
• 8 проб имели сомнительные результаты при исследовании тест-полоской ИХА-Фактор, вероятность ТГК-кислоты при исследовании методом ГХ-МС от 25 до 40 % (по материалам расследования – употребление конопли за 15–20, в одном случае за 30 дней до забора материала);
• при исследовании 25 проб тест-полоской ИХА-Фактор и методом ГХ-МС были получены отрицательные результаты.

Кроме того, при исследовании тест-полоской ИХА-Фактор 8 проб дали положительные результаты, в них были обнаружены: синтетические каннабиноиды ММВ(N)-BZ-F и AB-PINACA; совместно морфин, кодеин и меторфан (положительный тест на каннабиноиды и опиаты). В 5 пробах выявлен кетопрофен (кетонал).

Из 11 положительных результатов теста «Наркостоп» на опиаты 8 проб дали положительные результаты при исследовании тест-полоской ИХАФактор. В одном случае выявлено совместное нахождение в пробе морфина, кодеина и меторфана, в 7 случаях обнаружен инсектицид ДЭТА. При исследовании 3 проб тест-полоской ИХА-Опиаты-Фактор и методом ГХ-МС были получены отрицательные результаты.

Кроме того, в 6 пробах, показавших положительные результаты на метадон, при исследовании тест-полосками, методом ГХ-МС выявлен трамал. В 1 пробе, положительной по предварительному исследованию, методом ГХ-МС наркотические, сильнодействующие, психоактивные вещества не обнаружены.

В 2 пробах, давших положительные результаты на МДМА, выявлен дюспаталин. 1 проба (освидетельствуемый принимал мелоксикам, микардис, но-шпу, омепразол) дала положительный результат на фенциклидин. Методом ГХ-МС наркотические, сильнодействующие, психоактивные вещества не обнаружены.

В 1 пробе, положительной, по результатам ИХА на амфетамин, методом ГХ-МС выявлено совместное присутствие прокаина и антипирина.

Были проведены эксперименты, в ходе которых людям, при предварительном исследовании мочи которых были получены отрицательные результаты, были даны трамал, дюспаталин и кетонал. Через три часа после приема препаратов были получены результаты: при приеме трамала – положительный на метадон, дюспаталина – на МДМА и кетонала – на каннабиноиды.

Также были получены ложноположительные результаты на метамфетамин при исследовании мочи, взятой с нарушением требований (объекты были помещены во флаконы, содержащие остатки антибиотиков пенициллинового ряда – бензилпенициллин и ампициллин).

По результатам анализа полученных результатов можно сделать вывод, что тест-полоски различных производителей имеют разное количество ложноположительных результатов.

Для тест-полосок «Наркостоп» процент ложноположительных результатов, при анализе на каннабиноиды, составил 19,4 %, без учета случаев выявления других наркотических или лекарственных веществ. В то время как при исследовании тест-полосками Фактор-Мед случаев ложноположительных результатов, за исключением варианта с сомнительными результатами (6,2 %), не выявлено.

В ходе проведения химико-токсикологических анализов на наркотические и психотропные вещества был выявлены ряд лекарственных веществ, дающих ложноположительные результаты при иммунохроматографическом анализе: кетонал – на каннабиноиды; трамал – на метадон, дюспаталин – на МДМА и инсектицид ДЭТА – на опиаты.

Таким образом, методы ИФА, в частности иммунохроматографические тест-полоски, могут быть использованы исключительно для предварительного установления факта употребления одурманивающих средств. Результаты исследования должны быть подтверждены аналитическими методами, основанными на других физико-химических принципах (подтверждающими методами), например, газовой или жидкостной хроматографией с масс-селективным детектированием.

Список литературы

1. О порядке проведения медицинского освидетельствования на состояние опьянения (алкогольного, наркотического или иного токсического) : приказ МЗ РФ № 933н от 18.12.15.
2. Об организации проведения химико-токсикологических исследований при аналитической диагностике наличия в организме человека алкоголя, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ : приказ МЗ РФ № 40 от 27.01.06.
3. Вергейчик, Т.Х. Токсикологическая химия. – М. : МЕДпресс-информ, 2012. – C. 128–132.
4. Лабораторная диагностика острых химических отравлений : (пособие для врачей). – М., 2003. – C. 10–11.
5. Элленхорн, М.Дж. Медицинская токсикология: диагностика и лечение отравлений у человека / Метью Дж. Элленхорн. – М. : Медицина, 2003. – C. 55–57, 329–341.