Экстракция и идентификация прегабалина из биологического материала

Цель исследования – подбор оптимальных условий изолирования из биологических жидкостей.

Pregabalin – (S)-3-(аминометил)-5-метилгексановая кислота, С8Н12NО2; мол.м. 159,2; CAS 148553-50-8; рКа1 4,2, рКа2 10,6 [1]. Биодоступность – 90 %, Сmax в плазме достигается через 1 час (после приема пищи – до 2,5 часов), Т1/2 – 6,3 ч. Не связывается с белками плазмы, не подвергается метаболизму, около 98 % выводится в неизменном виде с мочой [1].

С ужесточением контроля за употреблением наркотических и психотропных средств участилось немедицинское применение лекарственных препаратов, не подлежащих обязательному контролю, зачастую в сочетании с алкогольными напитками.

Пример из практики. Труп гр. Я. обнаружен утром без признаков насильственной смерти, перед отбоем были жалобы на слабость и головокружение. В ходе осмотра места происшествия были обнаружены пустые блистеры из-под препарата «ЛИРИКА 300 мг Pfizer капсулы прегабалин», две капсулы указанного препарата, а также пустые бутылки из-под пива «Жигулевское». При вскрытии для судебно-химического исследования были взяты кровь и моча. При исследовании в крови и моче был обнаружен этиловый спирт в концентрации 2,61 мг/см3 и 2,76 мг/см3 соответственно. Наркотические и психотропные препараты (барбитураты, производные фенотиазина, 1,4-бензодиазепина, трициклические антидепрессанты) при исследовании не выявлены. При исследовании крови и мочи по общей схеме («скрининг» кислых – рН 2 и щелочных – рН 9 экстрактов) методом тонкослойной хроматографии (реагенты обнаружения: раствор нингидрина, FPN-реагент, реактив Драгендорфа, раствор подкисленного йодплатината, раствор хлорного железа, раствор нитрата ртути [2, 3]) каких-либо окрашенных пятен на хроматограммах в зонах экстрактов из крови и мочи не появилось.

Экспериментальная часть. Объектами исследования являлись: порошок прегабалина, трупная кровь и моча.

Подбор методов изолирования и определения. Порошок из капсулы (300 мг) растворяли в 300 мл дистиллированной воды. Был получен мутноватый раствор с рН 6. Концентрация препарата в растворе 1 мг/мл. С учетом рКа прегабалина (4,2 и 10,6) экстракцию проводили из кислой (рН 2) и щелочной (рН 11) среды, а также из нативного раствора с нейтральным значением среды (рН 6). По 1 мл раствора экстрагировали при рН 2, рН 6 и рН 11 трехкратно диэтиловым эфиром; хлороформом; этилацетатом. Идентификацию проводили методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором [2]. Экстракты растворяли в 0,5 мл хлороформа каждый, переносили в виалы и исследовали на хромато-массспектрометре фирмы AGILENT TECHNOLOGIES модели 5973N–6890N (USA) с капиллярной колонкой EVDX–5MS 25 м × 0,20 мм × 0,33 film. В качестве газаносителя использовали гелий со скоростью 1,0 мл/мин. Время задержки растворителя – 3,5 минуты. Температуру колонки программировали по следующей схеме: начальная температура 70 °С с изотермической выдержкой в течение 2 минут, с последующим температурным градиентом 15 °С/мин до 285 °С с изотермической выдержкой 15 минут, с последующим температурным градиентом 20 °С/мин до 295 °С с изотермической выдержкой 7 минут. Температура испарителя хроматографа – 270 °С, температура интерфейса МСД – 290 °С. Массспектрометр работал в режиме сканирования спектров электронного удара при 70 эВ диапазоне от 31 до 550 дальтон. Ввод образца в количестве 1 мкл осуществляли с помощью автосамплера в режиме постоянной скорости газаносителя. Проба вводилась в режиме без деления потока (splitless).

Анализ полученных хроматографических данных проводили с использованием программного обеспечения Hewlett-Packard G1540N MS ChemStation и масс-спектрометрической базы данных библиотеки NIST MS Search 2.0, предоставленных фирмой-производителем. Хроматографический поиск осуществляли с применением стандартной системы поиска АMDIS, методом ручной обработки хроматограмм, а также по избранным ионам. Для прегабалина избранные ионы – 141, 111, 84, 70, 56, 41. Вещества считались идентифицированными при совпадении масс-спектров полученных хроматографических пиков с библиотечными масс-спектрами с вероятностью более 80 %.

Были получены следующие результаты:

При исследовании выявлено, что процент вероятности увеличивался с увеличением рН, наилучшие результаты получены при значении рН 11; наиболее подходящим экстрагентом является хлороформ, вероятность определения для диэтилового эфира и этилацетата была значительно ниже 80 %.

Таким образом, наиболее оптимальным методом экстракции является трехкратное изолирование хлороформом при рН 11. Фрагмент хроматограммы и масс-спектр представлены на рисунках 1 и 2.

Полученные экстракты исследовались методом тонкослойной хроматографии по общим схемам для кислых и щелочных экстрактов. При обработке реактивами (раствор нингидрина, FPN-реагент, реактив Драгендорфа, раствор подкисленного йодплатината, раствор хлорного железа, раствор нитрата ртути) каких-либо окрашенных пятен не появилось.

По общей схеме исследования методом тонкослойной хроматографии с перечисленными выше реактивами прегабалин не выявлялся. Качественное определение возможно методом газожидкостной хроматографии с массселективным детектированием.

Исследование крови и мочи. Для выявления прегабалина (действующего вещества препарата «Лирика») по 5 мл крови (в разведении 1:1) и мочи из трупа гр. Я. подщелачивали до рН 11 и трижды экстрагировали хлороформом. Экстракты объединяли, обезвоживали и испаряли в токе теплого воздуха до сухого остатка.

Экстракты растворяли в 0,5 мл хлороформа каждый, переносили в виалы и исследовали на хромато-масс-спектрометре фирмы AGILENT TECHNOLOGIES модели 5973N–6890N (USA) с капиллярной колонкой EVDX–5MS 25 м × 0,20 мм × 0,33 film при указанных выше условиях. Масс-спектрометр работал в режиме сканирования спектров электронного удара при 70 эВ диапазоне от 31 до 550 дальтон. Ввод образца в количестве 1 мкл осуществляли с помощью автосамплера в режиме постоянной скорости газа-носителя. Пробы вводились в режиме без деления потока (splitless).

В экстрактах из крови и мочи трупа гр. Я. был выявлен прегабалин. Время удерживания прегабалина из биологических объектов совпало со временем удерживания прегабалина из капсулы препарата «Лирика». Фрагменты полученных хроматограмм и масс-спектры представлены на рисунках 3–6.

Вероятность прегабалина в экстракте из крови несколько ниже 80 %, что может быть связано с низкой концентрацией препарата.

Рис. 1. Фрагмент хроматограммы экстракта (рН 11) из капсулы препарата «Лирика», время удерживания 9,969 мин

Рис. 2. Спектр прегабалина (88,7 %) из экстракта в сравнении с библиотечным

Рис. 3. Фрагмент хроматограммы экстракта (рН 11) из крови, время удерживания – 9,962 мин

Рис. 4. Спектр прегабалина (78,2 %) из экстракта крови в сравнении с библиотечным

Рис. 5. Фрагмент хроматограммы экстракта из мочи (рН 11), время удерживания – 9,962 мин

Рис. 6. Спектр прегабалина (82,6 %) из эктракта мочи в сравнении с библиотечным

Также методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием исследовались кислые (рН 2) и нейтральные (рН 6–7) хлороформные экстракты из крови и мочи. Вероятность обнаружения прегабалина составила менее 50 %.

В результате проведенного исследования установлено, что максимальная степень экстракции прегабалина, как для водного раствора вещества, так и при исследовании биологических жидкостей, наблюдалась при изолировании хлороформом из подщелоченных (рН 11) объектов. Определение проводилось методом газовой хроматографии – масс-спектрометрии; методом тонкослойной хроматографии по стандартным схемам исследования прегабалин не выявлялся.

Изучено влияние факторов экстракции (природа органического экстрагента и рН среды) на изолирование прегабалина из растворов.

Разработана методика экстракции прегабалина из биологических жидкостей (кровь, моча).

Проведено качественное определение прегабалина в экстрактах из крови и мочи методом газовой хроматографии – масс-спектрометрии.

Список литературы

1. ВИДАЛЬ. Лекарственные препараты в России : справ. – 15-е изд. – М., 2009.
2. Идентификация наркотических и психоактивных веществ в биологических жидкостях и волосах методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием : информ. письмо. – М., 2014.
3. Основы аналитической токсикологии. – Женева : ВОЗ, 1997. – С. 63–76.
4. Clarke’s Analysis of Ddugs and Poisons / ed. A.C. Moffat. – s. l., 2011.