Замечания по технике окрашивания

При окраске водными красителями срезы переносят в краситель из дистиллированной воды, а при окраске спиртовыми — из соответствующего раствора спирта. После того как препарат приобретает интенсивную окраску, его промывают в воде или спирте для удаления избытка красителя (дифференцировка), контролируя этот процесс под микроскопом.

Срезы тканей после целлоидиновой и парафиновой заливки, а также полученные на замораживающем микротоме окрашивают в широкогорлых бюксах или на часовых стеклах. Одновременно окрашивают несколько срезов, промывают, дифференцируют и т.д. каждый срез отдельно.

Препараты можно помещать в красящий раствор в специальных контейнерах, предназначенных для одновременного окрашивания большого количества стекол. Если препаратов немного, то рациональнее краситель наносить непосредственно на срез по каплям с помощью пипетки. Остатки красителя можно слить в склянку и использовать повторно. Д. Кисели (1962) предлагал накрывать при этом срезы стеклянным колпаком, а для увлажнения среды оставлять под колпаком смоченную водой вату.

1. ЯДЕРНЫЕ КРАСИТЕЛИ И ИХ ПРИГОТОВЛЕНИЕ

Окрашивание ядер клеток обусловлено двумя механизмами химического взаимодействия: 1) основные красители, например анилиновые, образуют соли в присутствии ДНК и РНК; 2) образуются комплексы с ионами металлов при применении протравы. В практической работе чаще используют протравные красители. К ним относятся гематоксилин, кармин, сафранин, галлоцианин, ализарин. Хорошо окрашивают ядра такие красители, как янус зеленый, основной коричневый, оксазиновые красители (крезиловый фиолетовый, нильский голубой), тионин, азуры, метиленовый синий, основной фуксин, метиловый зеленый и др. Следует упомянуть о хороших результатах окраски ядер соком черники, которая предложена М.Д. Лавдовским еще в 1887 г.

Гематоксилин и способы его приготовления

Гематоксилин имеет растительное происхождение: его получают из эфирного экстракта кампешевого дерева. Гематоксилин хорошо растворяется в спирте и плохо в воде. Красящими свойствами обладает продукт окисления гематоксилина — гематеин, поэтому краситель становится пригодным только после созрева­ния — окисления, на которое требуется от 10 дней до 2—3 нед. Созревание можно ускорить с помощью солей алюминия, хрома, железа и др.

Гематоксилин Эрлиха

1.      Гематоксилин кристаллический   2г

2.      Спирт 96%                   100мл

3.      Дистиллированная вода       100 мл

4.      Глицерин                    100 мл

5.      Алюмокалиевые или алюмоаммонийные квасцы 3г

6.      Ледяная уксусная кислота    10 мл

Гематоксилин растворяют в спирте, а квасцы — в дистиллированной воде, смешивают оба раствора и затем добавляют остальные компоненты. Раствор периодически перемешивают. Через 10—14 дней он приобретает темно-вишневый цвет, что свидетельствует о готовности красителя. Продолжительность окрашивания гематоксилином Эрлиха 4—6 мин. Затем следуют промывание в дистиллированной, потом в водопроводной воде, дифференцировка в 1 % солянокислом спирте, восстановление в  аммиачной воде и окончательное промывание в дистиллированной воде. Для приготовления солянокислого спирта  к 100мл-70% спирта добавляют 1мл концентрированной соляной кислоты. Для приготовления аммиачной воды к 50мл дистиллированной воды добавляют 2 капли крепкого аммиака.

Результат: ядра клеток тёмно-синие(оболочка, хроматин), ядерный матрикс бледно-голубой или прозрачный.

Гематоксилин Делафильда

1.      Гематоксилин кристаллический                      4гр

2.      Спирт 96%                                                          25мл

3.      Алюмокалиевые или алюмоаммониевые квасцы   40гр

4.      Дистиллированная вода 400мл

Приготовление: спирт+гематоксилин+квасцы=3-4дня на свету, перемешывая,фильтруют+100мл глицерина+100мл метилового спирта=3-4 дня на свету, фильтруют. Перед применением разбавляют в 2 раза дистиллированной водой или 2% раствором алюмокалиевых квасцов.Окрашывание 4-6 минут, промывание в дистиллированной воде, дифференцировка в солянокислом спирте, восстановление в амиачной воде, промывание в ДВ.В результате хроматин и кариолемма ярко-синие.

Гематоксилин Гарриса

1.      Кристалическый гематоксилин 5 гр + спирт 50мл-96%

2.      Алюмоамонийные квасцы 100гр+ ДВ 1литр

3.      Смешывают + 60мл глицерина + 2,5 оксида ртути. Нагревают до 100С, остужают, фильтруют. Перед использованием до 100мл раствора добавляют 2 мл ледяной уксусной кислоты. Окраска 3-4 минуты, дает чёткие ярко-синие ядра.

 

Гематоксилин Гарриса в модификации Кисели

Исключил квасцы.

1.      Кристалическый гематоксилин 1 гр + спирт 10мл-96%

2.      Кристалический гематоксилин 20гр + ДВ 200мл

3.      Смешивают, доводят до кипения, + 500мг желтого оксида ртути. Остужают, фильтруют, готов к использованию. Окраска 4-6 минут, дает ярко-синие ядра.

 

Гематоксилин Ганзена

4.      Кристалическый гематоксилин 1 гр + спирт 10мл-100%

5.      Алюмокалиевые квасцы 20гр+ ДВ 100мл

6.      Смешывают + 3мл насыщеного раствора перманганата калия. Нагревают до 100С, остужают, фильтруют. Окраска 3-4 минуты, дает красно-фиолетовые ядра.

 

Гематоксилин Маллори(водный)

Кристалическый гематоксилин 2,5 гр + алюмоамонийные квасцы 50гр+ ДВ 1литр

Выдержывают 10 суток при 25С, +440мг перманганата калия и 2,5гр тимола, перемешивают,

фильтруют. Синие ядра.

 

Кислый гемалаун Майера(водный)

1.      Кристалический гематоксилин 1 гр

2.      Алюмоамонийные квасцы 50гр

3.      ДВ 1литр

4.      Йодат натрия 200мг

5.      Хлоралгидрат 50гр

6.      Лимонная кислота 1 гр

Квасцы растворяют в воде без нагревания, затем добавляют и растворяют гематоксилин, йодат натрия, лимонную кислоту и последним - хлоралгидрат. После растворения всех компонентов краску фильтруют, и она готова к применению.

Продолжительность окрашивания 4—6 мин.

Результат: ядра красно-фиолетовые.

Гематоксилин Кораци (водный)

1.      Гематоксилин кристаллический            0,1 г

2.      Йодат калия                            2—3 кристал

3.      Алюмокалиевые квасцы                   5 г

4.      Дистиллированная вода (теплая)                100 мл

Смесь перемешивают до полного растворения и добавляют 25 мл глицерина. Раствор перед использованием фильтруют. Продолжительность окрашивания 1—2 мин. Результат: ядра ярко-синие.

Железный гематоксилин Гейденгайна

1.      Гематоксилин кристаллический         1 г

2.      Спирт 96 %                           10мл

3.      Дистиллированная вода                90 мл

Краситель созревает 4 нед. Добавление 100 мг йодата натрия ускоряет «созревание» — он готов к использованию уже через 1 ч после приготовления. Окрашивание проводят разведенным в 2 раза раствором.

Продолжительность окрашивания 1 —36 ч.

Методика окрашивания

1. Препарат помещают в 2,5 % раствор железоаммонийных квасцов на 2—12 ч.

2. Ополаскивают в дистиллированной воде.

3. Окрашивают гематоксилином Гейденгайна 1—36 ч.

4. Промывают в водопроводной воде — 3 смены по 10 мин, затем обезвоживают, просветляют, заключают.

Результат: ядра и цитоплазматические структуры черные и синевато-черные.

Железный гематоксилин Брусси

1.      Гематоксилин кристаллический      1 г     I

2.      Дистиллированная вода при 40 "С   100 мл I

3.      Железоаммонийные квасцы           8 г  II

4.      Дистиллированная вода при 40 "С   100 мл  II

Растворы I и II смешивают, фильтруют. Продолжительность окрашивания 30 с—1 мин. Затем промывают в водопроводной воде, обезвоживают, просветляют заключают.

Результат: ядра синевато-черные.

 

Железный гематоксилин Вейгерта

1.      Гематоксилин кристаллический        1 г А

2.      Спирт 96 %                        100мл А

3.      Раствор трихлорида железа гексагидрата 50%-4 мл  В

4.      Дистиллированная вода               95 мл        В

5.      Концентрированная соляная кислота   1 мл  В

Растворы хранят в отдельных склянках с притертыми пробками. Перед использованием нужное для окрашивания количество краски получают путем смешивания растворов А и Б в пропорции 1:1.

Продолжительность окрашивания 1—2 мин, затем промывают в водопроводной воде.

Результат: ядра черно-синие.

 

Другие ядерные красители

Кармин

• Кармин                    1 г
• Дистиллированная вода   100 мл
• Раствор кипятят 15 мин, охлаждают, фильтруют, добавлявляют
• 10 мл 40 % формалина.

Продолжительность окрашивания 30 мин—24 ч. Затем следует промывание в дистиллированной воде, дифференцировать в солянокислом спирте, обезвоживание, просветление и заключение.

Результат: ядра ярко-красные.

Сафранин

Обеспечивает получение хороших результатов после фиксации ткани в тетраоксиде осмия и особенно после применении фиксаторов, содержащих хром.

• Основной раствор:Сафранин-10г + Спирт 96-155мл + Дистилл вода-145мл
• Краситель: -Основной р-р 20мл + Спирт 50%-80мл

Продолжительность окрашивания 24 ч. Затем следуют промывание дистиллированной водой, дифференцировка в солянокислом спирте, дистиллированная вода, обезвоживание, просветление и заключение.

Результат: хроматин ядер и кариолемма ярко-красные.

Галлоцианин

Рекомендуется для окрашивания тканей, залитых в желатин.

• Галлоцианин       100 г
• Хромовые квасцы          5 г
• Дистиллированная вода   100 мл

Сначала растворяют квасцы, затем добавляют Галлоцианин, раствор кипятят при постоянном помешивании, охлаждают, фильтруют. Срок годности красителя 1 мес.

Продолжительность окрашивания 24—48 ч. Затем следуют промывание в 2 сменах дистиллированной воды, обезвоживание, просветление и заключение.

Результат: хроматин и тигроидное вещество синевато-черные.

Сок черники

Свежие чистые ягоды черники разминают в фарфоровой ступке, смешивают с равным объемом 96 % спирта, настаивают 1— 2 сут и фильтруют. Перед окрашиванием часть раствора разводят равным количеством 2 % водного раствора алюмокалиевых квасцов и добавляют 2—3 кристаллика тимола.

Продолжительность окрашивания 5—7 мин. Затем следуют промывание в дистиллированной воде, дифференцировка в солянокислом спирте, промывание в дистиллированной воде, обезвоживание, просветление и заключение.

Результат: ядра темно-фиолетовые.

2. ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ КРАСИТЕЛИ

Окрашивание цитоплазмы клеток происходит в результате связывания оснований и белков кислотными красителями. В группу диффузных (кислых) красителей входят карбоновые и сульфоновые кислоты, нитро-, азокрасители и др. В гистологической практике постоянно применяют эозины, пикриновую кислоту, оранжевый Г, кислый фуксин, конго красный (конгорот), азокармин, эритрозин. Чаще используют 1 % водные растворы этих красителей, но можно применять и 1 % спиртовой раствор.

Продолжительность окрашивания колеблется от 5 с до 3—5 мин в зависимости от сорта и серии красителя. Если препарат перекрашивается, то излишек краски легко удаляется при ополаскивании в дистиллированной воде и последующем обезвоживании препарата или среза в спиртах.

Смесь кислого фуксина и пикриновой кислоты (пикрофуксин) готовят из насыщенного водного раствора пикриновой кислоты и 1 % водного раствора кислого фуксина (см. главу 22).

3. Методика окраски гематоксилином и эозином

Процедура окрашивания срезов, полученных на замораживающем микротоме, после парафиновой или целлоидиновой заливки различается лишь по техническим приемам, а порядок проведения окраски одинаков.

1. Дистиллированная вода            ополоснуть
2. Раствор гематоксилина            1—20 мин
3. Дистиллированная вода          ополоснуть
4. Солянокислый спирт       дифференцировка
5. Аммиачная вода       срезы синеют (контроль под микроскопом)
6. Проточная вода            5—10 мин
7. Дистиллированная вода    ополоснуть
8. Раствор эозина          10 с—3 мин
9. Спирт 96 %,
10. карбол-ксилол, заключение.

Результат: ядра синие, цитоплазма и межклеточное вещество розовые.