Обнаружение, изолирование и определение изониазида в трупном материале

В судебно-химической практике приходится встречаться с противотуберкулезным средством — изониазидом.

В литературе для анализа этого препарата предложен ряд способов: цветная реакция с 1, 2, 4-аминонафтол-сульфокислотой, реакции с пентацианоаминоферроатом и с цианистым калием, флюорометрический и микробиологический методы, реакции с фосфорномолибденовой кислотой, с нитропруссидом натрия, сернокислой медью и др.

Однако научно обоснованной методики для исследования трупного материала на изониазид не предложено.

Настоящее сообщение посвящено разработке новых качественных реакций на это вещество и метода определения его. Уделено внимание и вопросам изолирования, обнаружения и определения изониазида в трупном материале.

На чистом препарате мы разработали микрокристаллические и цветные реакции.

К капле водного раствора препарата прибавляют каплю 10% раствора азотнокислого серебра. Через 3—5 мин. образуются призматические кристаллы или их сростки в виде снопов. Открываемый минимум 20 мкг; предельное разведение 1:200.

К капле водного раствора препарата прибавляют каплю 2% раствора хлорида кадмия. Через 5—10 мин. образуются сростки игольчатых кристаллов в виде снопов и сфероидов. Открываемый минимум 250 мкг, предельное разбавление 1:400.

Рис. 1. Изоникотинил-салицил-альдазин (с чистым препаратом). ×48.

К капле водного раствора препарата прибавляют каплю 5% раствора сулемы. Через несколько минут образуются длинноигольчатые кристаллы и их сростки в виде пучков. Открываемый минимум 100 мкг; предельное разведение 1:200.

Реакция с салициловым альдегидом. По данным Ф. Файгля (1962), гидразид или ион гидразиния, конденсируясь с салициловым альдегидом, образует светло-желтый салицил-альдазин, обладающий желто-зеленой флюоресценцией в ультрафиолетовом свете. На характерную кристаллизацию автор не указывает. В наших опытах к капле водного раствора препарата прибавляли каплю насыщенного водного раствора салицилового альдегида. Через 5—40 мин. образовались кристаллы— бесцветные дендриты в виде листьев папоротника, лестниц и гребней (рис. 1), флюоресцировавшие желто-зеленым цветом в ультрафиолетовом свете. Открываемый минимум 4 мкг; предельное разведение — 1:10000.

К капле спиртового раствора препарата прибавляют по капле 1 % спиртового раствора м-динитробензола и 10% раствора едкого натра и нагревают смесь в кипящей водяной бане. Смесь окрашивается в фиолетово-красный цвет. Открываемый минимум 20 мкг; предельное разведение 1:20 000. Свободный гидразин в этих условиях дает розовое окрашивание на холоду.

Проверка специфичности этих реакций показала, что кристаллы другой формы образуют люминал, пирамидон и стрихнин с сулемой, а также бромурал с салициловым альдегидом. Нембутал, барбамил, ноксирон, пипольфен, депаркин, пахикарпин, эрготал, фтивазид, метацид, атропин, резохин, платифиллин, резерпин, кокаин и дикаин или совсем не реагировали или давали аморфные осадки. Сходное с м-динитробензолом окрашивание давали резохин, пипольфен, резерпин и эрготал. Таким образом, все реакции, кроме реакции с м-динитробензолом, специфичны.

Изолирование изониазида из трупного материала

Изониазид растворим в воде (1:8), спирте (1:50), ацетоне (1:60), хлороформе (1:850), эфире (1: 1000), изоамиловом спирте (1:400). Таким образом, большим препятствием для изолирования этого вещества является его плохая растворимость в несмешивающихся с водой растворителях. Это подтверждалось и в опытах по извлечению изониазида из воды при разных значениях pH. В 100 мл воды растворяли 100 мг препарата, создавали pH среды 1:4:10 и извлекали хлороформом (4×15 мл). По испарении хлороформа остатки растворяли в 6 мл воды, добавляя 4 мл 4% раствора азотнокислой меди и 2, 5 мл ацетона, и колориметрировали (метод Зоммера) на фотоэлектроколориметре ФЭК-М (светофильтр синий, кювета 20 мм, барабан левый, раствор сравнения — смесь воды и реагентов). По калибровочному графику, составленному аналогично в пределах 1, 0—100 мг (с интервалами 1 —10 мг), находили содержание изониазида в пробе. Результаты опыта показаны в табл. 1.

Таблица 1

Извлекаемость изониазида хлороформом в зависимости от pH среды (добавлено 100 мг)

Таким образом, некоторое количество изониазида (0,60—1,76%) извлекается и из кислой среды. При pH 10, 0 извлекается в среднем 10% изониазида. Такой выход для изониазида нельзя считать удовлетворительным. Это наводило на мысль о том, что при изолировании изониазида из трупного материала подкисленными спиртом или водой на стадии водного извлечения будут значительные потери. Поэтому представлялось целесообразным выделять изониазид из водной фазы, переводя его в труднорастворимое соединение. Для этой цели использовали реакцию изониазида с салициловым альдегидом. В щелочной среде продукт этой реакции дает желтое окрашивание, подчиняющееся в определенном диапазоне концентраций закону Ламберта — Бера. Поэтому данная реакция могла лечь в основу количественного определения изониазида. Эксперименты привели к следующей методике.

Исследование трупного материала на изониазид

К 100 г измельченного объекта добавляют 200 мл ацетона и оставляют на 2 часа, периодически помешивая. Извлечение фильтруют, выпаривают при 40° досуха, обрабатывают 25 мл воды, центрифугируют (10 мин., скорость 1500 об/мин). К аликвотной части надосадочной жидкости (5—10 мл) в центрифужной пробирке емкостью 10 мл прибавляют небольшую каплю салицилового альдегида, энергично взбалтывают смесь и оставляют ее на сутки. Каплю взмученной жидкости рассматривают под микроскопом. При наличии изодиазида видны характерные кристаллы (рис. 2). Смыв эту каплю опять в пробирку, жидкость центрифугируют (5 мин., 1500 об/мин). Надосадочную жидкость осторожно снимают пипеткой, а осадок промывают 2 раза водой (2 мл), центрифугируя. Промывные воды отбрасывают. К осадку прибавляют 0,1 н. раствор едкого натра до объема 10 мл и колориметрируют на фотоэлектроколориметре ФЭК-М (светофильтр синий, кювета 20 мм, барабан правый, раствор сравнения — вода) и по калибровочному графику находят содержание изониазида в пробе. Для этого количество миллиграммов (по графику) умножают на 0,73 (коэффициент, учитывающий выход продукта реакции изониазида с салициловым альдегидом и количество изониазида, которому от соответствует). Калибровочный график строят следующим образом.

В колориметрические пробирки емкостью 10 мл вносят от 1 до 10 мг продукта реакции изониазида с салициловым альдегидом, растворенного в 0,1 н. растворе едкого натра (интервал 1 мг). Объем жидкостей в пробирках доводят 0,1 н. раствором едкого натра до 10 мл. Перемешивают и колориметрируют, как и исследуемую пробу. Закон Ламберта—Бера соблюдается от 0,5 до 10 мг. Чувствительность метода 0,5 мг. Если оптическая плотность исследуемых проб выходит за верхний предел калибровочного графика, допускается разведение 0,1 н. раствором едкого натра. Это учитывают при расчете. Продукт реакции изониазида с салициловым альдегидом синтезируют следующим образом. К 50 мл 1% раствора изониазида прибавляют 1—2 капли салицилового альдегида, энергично взбалтывают смесь и оставляют ее на сутки. Выделившийся осадок отфильтровывают и промывают водой, после чего сушат между листами фильтровальной бумаги, а затем в сушильном шкафу при температуре 50—70°. Выход его равен 7-8—80%. Разрешающие возможности этой методики на чистом препарате показаны в табл. 2.

Как видно из этих данных, абсолютная ошибка метода колеблется в пределах 7%.

Таблица 2

Определение изониазида в растворах

Рис. 2. Изоникотинил-салицил-альдазин (из трупного материала). ×48.

Оставшуюся часть извлечения исследуют другими качественными реакциями. В наших опытах хорошей воспроизводимостью и специфичностью в отношении биологического материала также обладала реакция с нитропруссидом натрия (1%) и едким натром (10%) (быстроисчезающее пурпурное окрашивание с гнилостным материалом не имеет решающего значения); реакция с пикриновой кислотой (шарообразные сростки игольчатых кристаллов) и реакция с п-диметиламинобензальдегидом (сине-зеленая флюоресценция). Реакция с фосфорномолибденовой кислотой была положительна и в контрольных опытах. Чувствительность и специфичность методики проверяли исследованием навесок печени (100 г) с добавлением (или без добавления) изониазида. При этом количественное определение производилось также по методу Зоммера. Результаты трех параллельных опытов представлены в табл. 3.

Таблица 3

Чувствительность и специфичность методики

Как видно из этих данных, граница обнаружения и определения изониазида равна 10 мг в 100 г объекта. Метод Зоммера дает несколько завышенные результаты (102,11%). Сравнительное изучение 3 способов изолирования (печень, 100 г) показано в табл. 4.

Эти данные свидетельствуют о том, что предлагаемый метод дает более высокий выход (76, 6%) по сравнению с другими методами; это позволяет рекомендовать его для использования в судебно-химической практике.

Была также изучена возможность применения разработанной методики для исследования гнилостного материала. С этой целью к 100 г печени, находившейся в стадии гнилостного разложения, прибавляли 100 мг изониазида. После перемешивания и суточного стояния исследовали смесь по разработанной методике. Среднее арифметическое из 3 параллельных опытов по изолируемости составило 65, 8%. В контрольных опытах результаты были отрицательные.

Таблица 4

Изолируемость изониазида разными методами (добавлено 100 мг)

Выводы

1. Предложено 5 новых качественных реакций на изониазид. Из них наиболее чувствительна и специфична реакция с салициловым альдегидом.
2. Предложен метод определения изониазида на основе реакции с салициловым альдегидом. Чувствительность его 0, 5 мг, а точность ±5%.
3. Изучены способы изолирования изониазида из биологического материала. Наиболее высокий выход изониазида 76% при извлечении ацетоном.
4. Предложена методика исследования трупного материала на изониазид. Чувствительность ее 10 мг в 100 г объекта. Она пригодна также для исследования трупного материала, находящегося в состоянии гнилостного разложения.