Выявление спермина в пятнах спермы путем электрофореза на бумаге

Идентификация семенных пятен путем обнаружения сперматозоидов не всегда удается. Ее нельзя осуществить в случаях азооспермии; иногда отрицательный результат исследования наблюдается при грубом механическом повреждении пятна.

В связи с этим в последнее время много работ посвящается методам доказательства присутствия спермы, не зависящим от обнаружения сперматозоидов. Наиболее специфичны те, которые основаны па выявлении спермина.

В литературе описан метод хроматографии в различных вариантах, но он сопряжен с разрушением фосфатной связи в спермине и с переводом спермина в растворитель. Хроматографирование занимает 2—6 часов (в зависимости от свойств хроматографической бумаги и буфера).

Мы стремились устранить необходимость извлечения спермина из пятна и по возможности сократить срок анализа. С этой целью применяли метод электрофореза на бумаге.

Методика

Вырезают часть пятна размером 10×3 мм. С ворсистого материала можно срезать ворсинки с подсохшей спермой. Если материал очень тонкий (женское белье), две вырезки указанных выше размеров накладывают друг на друга. Объект смачивают 0,5 н. раствором соляной кислоты и через 10 мин. помещают на стартовую линию на хроматографической бумаге Шлейхер — Шил 2043 b, заранее насыщенной электролитом, — им служит цитратный буфер pH 4,6: А. 0,1 М раствор лимонной кислоты (21,01 г на 1 л воды); Б. 0,1 М раствор цитрата натрия (29,41 г на 1 л воды).

Для приготовления буфера смешивают 255 мл раствора А и 245 мл раствора В, добавляя воду (до 1 л). Вода должна иметь нейтральную реакцию.

В качестве материала для сравнения пользовались смесью спермина (фирма Fluko и Busch, Швейцария) и холина (в виде холинхлорида). Оба вещества растворяют в 0,5 н. растворе соляной кислоты и наносят на стартовую линяю на хроматографической бумаге одновременно с исследуемым объектом. Место старта передвигают ближе к аноду, так как оба вещества мигрируют к катоду. Электофорез продолжают 30 мин. при 15 в/см (измеряют у фитиля¹).

Полученную электрофореграмму высушивают и опрыскивают реактивом Драгендорфа. Реактив сохраняют на холоду в течение нескольких недель.

Спермин и холин образуют на электрофореграмма поперечные продолговатые зоны розово-оранжевого цвета. Если старт находится в 50 мм от фитиля (+), зона спермина появляется в 109 мм, а зона холина — в 120 мм от фитиля (по направлению к катоду). После побледнения желтоватой окраски от йода зона спермина приобретает розовый цвет и хорошо контурируется, а зона холина — фиолетовый цвет и становится расплывчатой.

Оценка результатов

Скорость миграции исследуемых веществ колеблется, так как соблюсти одинаковые условия электрофореза трудно. Это зависит от колебаний напряжения, от pH буфера и от расстояния стартовой линии от анода. Влияют на скорость миграции также температура и (косвенно) испарение воды. Повышение температуры на 1° увеличивает скорость миграции примерно на 3%. Испарение воды повышает концентрацию электролита, а тем самым — его проводимость и ионную силу. Бумага впитывает новую порцию раствора из электродных сосудов (так называемый фитильный эффект), в результате чего снижается напряжение тока. Имеют значение и другие факторы. Поэтому обязательно контрольное исследование смеси спермина и холина.

При определении изоэлектрической точки этих веществ установлено, что в указанных условиях спермин мигрирует максимально до 124 мм, а холин — до 138 мм от фитиля (+), несмотря на положение стартовой линии. Далее миграция равна нулю. Таким образом, с целью получения хотя бы приблизительно воспроизводимых результатов необходимо всегда соблюдать одинаковое расстояние стартовой линии от фитиля и анода (чтобы в процессе электрофореза миграция не достигала изоэлектрической точки) и относительно одинаковую насыщенность бумаги электролитом.

Приводимый метод, при котором можно пользоваться любой соответствующей аппаратурой, прост и быстро осуществим. Электрофорез не требует охлаждения. В зависимости от применяемого прибора напряжение можно снизить до 10 в/см, но тогда срок электрофореза удлиняется в 2—3 раза.

Мы испытывали методом электрофореза пятна выделений из влагалища, а также пятна слюны, пота, мочи, околоплодных вод и крови, но всегда получали отрицательный результат. При исследовании же пятен спермы, на которых находились указанные вещества, наличие спермина и холина всегда удавалось достоверно доказать.

¹ Фитиль — полоска фильтровальной бумаги, соединяющая хроматографическую бумагу с электродным сосудом.