Опыт использования метода твердофазной экстракции для изолирования фенобарбитала из мочи в условиях химико-токсикологической лаборатории ГАУЗ АО «Амурский областной наркологический диспансер»
/ Щепина Е.А., Рыбальченко Л.Б., Огилько М.В. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. — Хабаровск, 2018 — №17. — С. 238-243.
Государственное автономное учреждение здравоохранения Амурской области «Амурский областной наркологический диспансер» (гл. врач – Л.Б. Рыбальченко), г. Благовещенск
В последнее время, на наш взгляд, в силу ужесточения законодательства РФ в области оборота лекарственных препаратов, содержащих психоактивные или наркотические вещества, участились случаи злоупотребления барбитуратами, а именно лекарственными препаратами безрецептурной группы отпуска, содержащими фенобарбитал.
Стоит также отметить существующую проблему применения лекарственных средств, содержащих фенобарбитал, без назначения врача.
По данным химико-токсикологической лаборатории ГАУЗ АО «Амурский областной наркологический диспансер», доля исследований с положительным результатом на фенобарбитал из общего числа исследований с положительным результатом за 5 месяцев 2018 года составила 29 % (рис. 1).
Рис. 1. Структура химико-токсикологических исследований с положительными результатами за 5 месяцев 2018 года
Постепенно меняется структура немедицинского потребления психоактивных веществ. Например, в 2017 году основную их часть составляли каннабиноиды и опиаты – 72,9 % и 17,4 % соответственно. На долю остальных приходилось 0,7 %.
Распределение количества исследований на наличие фенобарбитала в зависимости от целей исследований показано на рисунке 2 (в диаграмме приведена структура положительных результатов).
Рис. 2. Структура химико-токсикологических исследований с положительным результатом на фенобарбитал по типу целей исследований
Учитывая большую долю исследований на наличие барбитуратов в структуре химико-токсикологических исследований, для изолирования фенобарбитала из крови и мочи было решено применять метод твердофазной экстракции. Нами было изучено некоторое количество методик, опубликованных в доступной специальной литературе, на сайтах производителей картриджей для твердофазной экстракции, в других интернет-источниках. Часть из них опробована. Ниже будут приведены опробованные методики и соответствующие им хроматограммы.
Оборудование и материалы
Система для ТФЭ с вакуумной камерой на 20 позиций Agilent Technolo- gies. Газовый хроматограф Agilent 7890B, оснащенный капиллярной кварцевой колонкой HP-5MS длиной 30 м, с внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной пленки 0,25 мкм. Масс-селективный детектор Agilent 7000C. Концентратор RVC 2-18 plus. Полуавтоматические пипетки-дозаторы, позволяющие отбирать объемы жидкостей 20–200, 200–1000 мкл и 1–5 мл. Делительная воронка.
Картриджи для ТФЭ: Sampli QE videx (200 мг/3 мл) со смешанной фазой; Bond Elut-C18 (200 мг/3 мл) serial/lot № 6373878-01; Bond Elut Certify (200 мг/ 3 мл) serial/lot № 6376900-02.
Реактивы: хлороформ; 95 % этанол; 10 % этанол; н-гексан; этилацетат; метанол; 2Н соляная кислота; 0,1 М уксусная кислота. Используемые буферные системы: 1/15 М фосфатный буфер (рН = 5); 0,1 М фосфатный буфер (рН=6).
Все используемые растворители и реактивы имели квалификацию х.ч.
Режим работы газового хроматографа с масс-селективным детектором Температура испарителя хроматографа и интерфейса детектора 250 и 280 °С соответственно. Температура колонки: начальная 60 °С в течение 1 мин, подогрев до 280 °С со скоростью 10 град/мин; выдержка при конечной температуре 1 мин. Скорость потока газа-носителя (гелий) через колонку 1,5 мл/мин. Режим работы испарителя splitless (продувка 50 мл/мин, 1 мин).
Напряжение на умножителе масс-селективного детектора устанавливали на 200 В выше величины автоматической настройки детектора. Регистрация масс-спектров в режиме полного сканирования ионов в интервале масс 40–550 а.е.
Обработку хроматограмм с целью идентификации проводили с использованием программы Mass Hunter.
Гидролиз конъюгатов не проводился.
1. Жидкость-жидкостная экстракция
2 мл мочи подкисляли 2Н раствором соляной кислоты до рН = 2, трижды экстрагировали 2 мл хлороформа. Центрифугировали при 3000 об/мин. Хлороформные фазы отделяли и объединяли, фильтровали через безводный сульфат натрия. Органический растворитель испаряли в вакуумном концентраторе при 30 °С до сухого остатка. Сухой остаток растворяли в 70 мкл безводного этилацетата и 1 мкл вводили в испаритель хроматографа. Хроматограмма представлена на рисунке 3.
Рис. 3. Хроматограмма после жидкость-жидкостной экстракции
2. Твердофазная экстракция, протокол 1.
ТФЭ для картриджа Sampli QE videx
Подготовка образца: 2 мл мочи; кондиционирование: 2 мл 95 % этанола, 2 мл 1/15 М фосфатный буфер (рН = 5); загрузка образца: со скоростью около 1 мл/мин; промывка: 1 мл 1/15 М фосфатный буфер (рН = 5), 1 мл 10 % этанола; сушка: под вакуумом в течение 20 мин; элюирование: дважды по 2 мл смеси н-гексан – этилацетат (3:1). Элюат высушивали до сухого остатка в вакуумном концентраторе при 30 °С. Сухой остаток растворяли в 70 мкл безводного этилацетата и 1 мкл вводили в испаритель хроматографа.
Хроматограмма представлена на рисунке 4.
Рис. 4. Хроматограмма после твердофазной экстракции, протокол 1
3. Твердофазная экстракция, протокол 2.
ТФЭ для картриджа Bond Elut – C18
Подготовка образца: К 2 мл мочи добавляли 1 мл 1/15 М фосфатный буфер (рН = 5) (рН объекта исследования 5, подкисляли 2Н соляной кислотой); кондиционирование: 3 мл метанола, 3 мл деионизированной воды, 1 мл 1/15 М фосфатный буфер (рН = 5); загрузка образца: со скоростью около 1 мл/мин; промывка: 3 мл деионизированной воды, 1 мл 0,1 М уксусной кислоты; сушка: под вакуумом в течение 5 мин; промывка: 2 мл н-гексана; элюирование: 3 мл смеси н-гексан – этилацетат (1:1). Элюат высушивали до сухого остатка в концентраторе при 30 °С. Сухой остаток растворяли в 70 мкл безводного этилацетата и 1 мкл вводили в испаритель хроматографа. Хроматограмма представлена на рисунке 5.
Рис. 5. Хроматограмма после твердофазной экстракции, протокол 2
Твердофазная экстракция, протокол 3.
ТФЭ для картриджей Bond Elut-C18, Bond Elut Certify (вариант № 2)
Подготовка образца: к 2 мл мочи добавляли 1 мл 0,1 М фосфатный буфер (рН = 6) (рН объекта исследования 6, подкисляли 2Н соляной кислотой); кондиционирование: через патрон пропускали 2 мл метанола, 2 мл 0,1 М фосфатный буфер (рН = 6); загрузка образца: со скоростью около 2 мл/мин; промывка: 1 мл смеси 0,1 М фосфатного буферного раствора pH = 6, метанола (4:1); сушка: под вакуумом в течение 5 мин; промывка: 1 мл 0,1 М уксусной кислоты; сушка: проводится под вакуумом в течение 10 мин; промывка: 1 мл н-гексана; элюирование: 4 мл смеси н-гексан – этилацетат (1:1) со скоростью 5 мл/мин.
Элюат высушивали до сухого остатка в концентраторе при 30 °С. Сухой остаток растворяли в 70 мкл безводного этилацетата и 1 мкл вводили в испаритель хроматографа.
Хроматограммы представлены на рисунках 6, 7.
Рис. 6. Хроматограмма после твердофазной экстракции, протокол 3, Bond Elut-C18
Рис. 7. Хроматограмма после твердофазной экстракции, протокол 3, Bond Elut-Certify
Таким образом, наиболее пригодной методикой для изолирования фенобарбитала из мочи методом твердофазной экстракции в условиях нашей лаборатории оказалась методика, описанная в протоколе 2.
Список литературы
Применение твердофазной экстракции в исследовании крови на наркотические и лекарственные вещества / Катаев С.С., Дворская О.Н. // Судебно-медицинская экспертиза. – 2012. – № 4. – С. 38–42.
United Chemical Technologies / Inc., Solid Phase Extraction/APPLICA- TIONS MANUAL. – С. 9–10.
Официальный сайт компании Agilent – http://www.agilent.com/
Официальный сайт компании Waters – http://www.waters.com/
похожие статьи
Особенности распределения 2,4- и 2,6-ди-трет-бутилгидроксибензола в организме теплокровных животных / Шорманов В.К., Цацуа Е.П., Асташкина А.П. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 2019. — №1. — С. 36-42.