Обнаружение эклипсных антигенов в трупной крови

Введение

В связи с развитием иммунологических методов антигенного анализа и применением их в судебно-медицинской практике биологических отделений неоднократно встречаются случаи, когда при определении антигенной структуры следов крови или выделений на различных предметах-носителях выявляются антигены, не свойственные данному организму. Поэтому представляется существенным вопрос о значении эклипсных антигенов микроорганизмов при определении антигенной структуры следов крови [2].

Практически все исследуемые пятна крови в различной степени обсеменены микроорганизмами, многие из которых обладают антигеноподобными свойствами, и, будучи выделенными из следов крови, способны формировать эклипсные антигены, сходные по структуре с антигенами А, В, Н человека, и вызывать неспецифическую агглютинацию тест-эритроцитов, вводимых в учетную фазу реакции абсорбции–элюции, которая практически всегда используется экспертами-биологами. Эклипсные антигены способны замаскировать истинную антигенную картину и привести к возможным ошибкам при определении групповой принадлежности [1].

Эклипсные (гетерогенные) антигены, сходные с антигенами тканей и клеток человека, выявлены в настоящее время у многих микроорганизмов. При исследовании 40 штаммов бактерий на наличие антигенов, родственных антигенам крови человека, гетерогенные эклипсные антигены выявлены у 13 штаммов. Так, антигены, родственные антигенам группы крови А, выявлены у Staphylococus aureus 209P и E. Coli O1П; антигены, родственные эритроцитам

группы крови В, выявлены у 6 штаммов бактерий кишечной группы и у 1 штамма дрожжеподобных грибов. У 3 штаммов бактерий кишечной группы выявлен антиген Н; у Staphylococсus epidermidis обнаружены антигены А и В. При исследовании этих микроорганизмов в реакции количественной модификации и абсорбции–элюции (в соответствии с методическими указаниями) выявлены аналогичные материалы.

Следует добавить, что групповые факторы крови (например, системы AB0) обнаружены не только у человека и некоторых бактерий, но и у различных млекопитающих и птиц [4].

Таким образом, обнаружение антигенной общности микроорганизмов и тканей млекопитающих не является случайным единичным фактом, это широко распространенное явление, исследование которого связано с развитием иммунологических методов антигенного анализа.

Кроме того, установлено, что в весенний, осенний и зимний периоды следы крови в 100 % случаев бывают обсеменены дрожжеподобными грибами, а в летний период – бактериями кишечной группы, споровыми грамположительными палочками, незначительным количеством кокковых форм.

Также у микроорганизмов, выделяемых из следов крови на вещественных доказательствах, чаще определяется антиген, родственный эритроцитам группы крови В [3].

Учитывая распространенность факторов групп крови среди практически всего животного мира, некоторые авторы намерены в ближайшее время поставить вопрос о целесообразности (или жестче – о прекращении) экспертиз по группам крови в судебной практике.

Таким образом, в экспертных целях необходимо учитывать генетические особенности не только непосредственных участников уголовного процесса, но и биологические возможности бактерий и организмов, а также возможности загрязнения экспертируемых образцов генным материалом различных видов животных и других организмов.

Материал и методы

В своей практической деятельности экспертыбиологи довольно часто сталкиваются с затруднениями определения групповой принадлежности трупной крови, которая зачастую предоставляется в гнилостно-измененном состоянии (с учетом обстоятельств уголовного дела), и определить групповую принадлежность крови в жидком виде и высушенной на стандартном бланке для определения крови бывает довольно сложно.

При исследовании образца крови от трупа Т. определить групповую принадлежность в жидком виде не удалось (кровь доставлена в виде однородной мутной жидкости, темно-коричневого цвета, с резким гнилостным запахом). Для дальнейшего исследования кровь выливали на стандартный бланк для определения крови, высушивали при комнатной температуре и исследовали в виде пятна. Для этого последовательно были использованы два метода: метод количественной абсорбции агглютининов с использованием изогемагглютинирующих сывороток анти-А, анти-В и лектина анти-Н и метода абсорбции–

элюции (РАЭ) с использованием цоликлонов анти-А, анти-В и анти-Н. При этом были получены противоречивые результаты: при исследовании методом КРА снижение тира было по 1-й ступени поглощения с изогемагглютинирующими сыворотками анти-А и анти-В, и 2-й ступени поглощения лектина антиН, а при использовании метода РАЭ выявлены антигены А, В и Н. В связи с тем, что при определении групповой принадлежности крови от трупа Т. в КРА и РАЭ (в соответствии с их методическими указаниями) были получены противоречивые результаты (наблюдалась неспецифическая агглютинация тестэритроцитов в учетную фазу реакции РАЭ, в меньшей степени КРА), было проведено микробиологическое исследование.

Микробиологическое исследование

Кусочки из исследуемого пятна крови и контрольные участки размером 0,3 × 0,3 см помещали в пробирки и заливали физиологическим раствором до 1 мл, встряхивали и оставляли на столе на 10–15 минут, затем 1 каплю переносили на МПБ и МПА, ставили в термостат на сутки, доставали и окрашивали по Граму: переносили 1 каплю из выросших колоний, растирали, фиксировали над пламенем спиртовки, окрашивали полученные мазки генцианвиолетом при помощи фильтровальной бумаги. Затем бумагу снимали, а мазки проливали водой. Последовательно наносили на мазки р-р Люголя на 1–2 минуты, после обрабатывали 96 % спиртом 1–2 минуты и опять проливали водой, в конце окрашивали фуксином. При микроскопическом исследовании обнаружены в значительном количестве микроорганизмы кишечной группы и разнообразная кокковая флора (стафилококки, стрептококки) и дрожжеподобные грибы, т.е. представители микрофлоры, обладающие способностью формировать эклипсные антигены, сходные по антигенной структуре с антигенами системы АВО. Для проверки этого факта было проведено следующее исследование: оставшиеся колонии и контрольные участки делили на 2 части («А» и «Б»). Колонии части «А» предварительно фиксировали метанолом 20 минут, а колонии части «Б» – кипячением в течение 30 минут, после такой фиксации заливали цоликлонами анти-А, анти-В и анти-Н в титре 1:128 и проводили абсорбцию по стандартной методике (РАЭ). В результате в части «A» колонии агглютинация наблюдалась с тест-эритроцитами А, В и Н, а в части «Б» – отсутствовала (что свидетельствует о вероятной гибели части микроорганизмов). Таким образом, было доказано присутствие в образце крови Т. эклипсных антигенов микроорганизмов.

Для устранения влияния микрофлоры и продуктов ее распада образец крови последовательно обрабатывали хлороформом, несколько раз в течение 5 минут, пока хлороформ с вырезками из пятна крови не стал чистым. Затем помещали на 3 минуты в кипящий формалин и повторно исследовали в КРА и РАЭ. В результате проведенной РАЭ агглютинация наблюдалась только с тестэритроцитами Н, а в КРА выявлено 8 ступеней поглощения лектина анти-Н. Таким образом было установлено – кровь потерпевшей Т. относится к группе 0(Н) альфа, бета.

Кроме того, при проведении подобных исследований многие авторы предлагают вносить некоторые изменения в классические методики в зависимости от ситуации, а именно – прогревание пятен в течение 30 минут при температуре 120 °С; обработка изучаемого смешанного пятна 10 % альбумином; укорачивание времени абсорбции и проводить элюирование в физиологический раствор и т.п.

Результаты и обсуждение

При определении групповой принадлежности гнилостно-измененной трупной крови Т. с использованием методов количественной абсорбции и абсорбции–элюции (РАЭ) были получены противоречивые результаты. При бактериальном исследовании выявлены микроорганизмы кишечной группы, разнообразная кокковая флора (стафилококки, стрептококки) и дрожжеподобные грибы, т.е. микроорганизмы, способные формировать эклипсные антигены. Для устранения влияния микрофлоры и продуктов ее распада образец крови Т. последовательно обрабатывали хлороформом и помещали в кипящий формалин. После повторного исследования в КРА и РАЭ агглютинация наблюдалась только с тест-эритроцитами Н и в КРА выявлено 8 ступеней поглощения лектина анти-Н. Таким образом, после проведения дополнительных исследований групповая принадлежность крови была установлена.

Выводы

Гнилостно-измененная трупная кровь практически всегда обсеменена микроорганизмами.

Выявление эклипсных антигенов микроорганизмов при использовании для определения групповой принадлежности крови методов количественной абсорбции (КРА) и абсорбции–элюции (РАЭ) может привести к экспертным ошибкам.

При получении противоречивых результатов КРА и РАЭ необходимо провести бактериальное исследование крови и устранить влияние микрофлоры. Проведение исследований в полном объеме позволит эксперту при составлении выводов объяснить противоречивость полученных результатов и избежать ошибок при определении групповой принадлежности крови.

Список литературы

1. Обнаружение эклипсных антигенов эритроцитов человека и микроорганизмов, выделенных из следов крови на вещественных доказательствах / О.В. Болдырева, В.И. Акопов, А.Е. Эссель, И.А. Косаревская. – Текст : непосредственный // Судеб.-мед. экспертиза. – 1988. – № 1. – С. 28–29.
2. Гуртовая, С.В. К вопросу о сперме, смешанной с калом / С.В. Гуртовая. – Текст : непосредственный // Сборник научных статей по судебной биологии. – М., 1999. – С. 16–17.
3. Тюняев, А.А. Экологические и эволюционные аспекты распределения частот групп крови : докл. в Ин-те проблем экологии и эволюции РАН 27.02.2010 г. / А.А. Тюняев. – Текст : электронный. – URL: http://www.organiz mica.org/archive/703/eiea.shtml (дата обращения 01.10.2019).
4. Тюняев, А.А. Группы крови : синдром гомеологическо-хромосомного иммунодефицита / А.А. Тюняев ; Акад. фундамент. наук, Рос. акад. естеств. наук. – М. : Спутник+, 2009. – 335 с. – Текст : непосредственный.