Метод избирательной абсорбции при определении кровяных групп в кровяных пятнах

Эту работу свою посвящаю другу моему, проф. Ф.Н. Жмайловичу, по поводу 25-летия его деятельности.

В своей первой работе о технике определения кровяных групп в кровяных пятнах¹ я только мимоходом упомянул о методе избирательной абсорбции, так как в то время еще не обладал достаточным количеством опытов и наблюдений. В настоящее же время, проделав их большое количество и, как мне кажется, вполне овладев техникой, я к великому своему удовольствию пришел к заключению, что метод этот необходимо поставить на первом плане среди остальных, рассмотренных в упомянутой выше работе. По своей сравнительной несложности, изяществу, по своей доказательности, а главное потому, что он допускает такую значительную давность пятен, .о которой нечего думать, применяя способы обнаружения агглютининов, он не имеет себе равных. На этом основании в каждом судебном случае этот метод должен быть применяем прежде всего. Можно с уверенностью сказать, что если путем абсорбции не удается получить почему либо решения вопроса о кровяной группе пятна, то его volens-nolens придется оставить открытым, так как другими путями разрешить его вряд ли будет возможно.

Преимущества метода абсорбции в общем заключаются в следующем: здесь мы определяем не тот или иной агглютинин, но агглютиноген (в дальнейшем будем пользоваться терминами антитело и антиген). Принимая же во внимание, что антитела очень нестойки против всяких разрушительных агентов, имеющих в судебно-медицинской практике первостепенное значение (на первом плане давность пятна, затем температура в момент его образования и др.), что антител нет совершенно в группе АВ, что их нет также у очень маленьких детей (повидимому до 1,5 года), что их может не быть в преклонном возрасте (точнее — они настолько подвергаются процессу инволюции, что доказательство их может оказаться трудным), — принимая все это во внимание, становится ясным, что, несмотря на проведенную lege artis технику, все равно известный процент пятен, так сказать, расшифровке не поддается.

Другое дело с антигенами: стойкость их гораздо значительнее. По авторам они с успехом переносят даже воздействие многочисленных химических агентов. Возраст также роли не играет, так как особенность эта доминантная — передается по наследству и имеется налицо уже у новорожденного. Правда, в группе 0αβ их тоже, конечно, нет, но в этом случае путем метода абсорбции и становится возможным доказать, что их нет, т. е., что кровь в данном пятне принадлежит именно к группе 0αβ. Помимо всего сказанного, метод этот допускает проверочный контроль, что является, конечно, неоценимым плюсом.

Для незнакомых с вопросом в двух словах скажу о теоретическом обосновании разбираемого метода.

Если на засохшую кровь неизвестной группы подействовать сывороткой, содержащей оба антитела (т. е. αβ), то при известных температурных условиях произойдет связывание содержащегося в сухом кровяном остатке антигена (конечно, если он там есть, т. е. если кровь не принадлежит тоже к группе 0αβ) с соответствующим антителом. По истечении некоторого времени связывание это будет настолько полным, что из сыворотки αβ совершенно исчезнет то или иное (или оба, если в кровяном пятне имеются оба антигена) антитело или, как принято говорить, сыворотка «истощится» на то или иное (или оба) антитело. Если теперь таким образом «истощенную» сыворотку последовательно испытывать эритроцитами А и В, то увидим, что она резко изменилась: она не даст уже реакции с тем видом эритроцитов, чье соответствующее антитело было связано с антигеном, находившемся в сухом кровяном остатке. Если, напр., из сыворотки исчезло антитело α, то в кровяном пятне находился антиген А, т. е., кровь принадлежала к группе Аβ, и т. д. Что здесь нет ошибки технического характера, можно убедиться контрольным опытом, о котором речь будет ниже.

Свои наблюдения и опыты я производил с пятнами от крови человека, при чем, как и раньше, в качестве материала служили мне части окровавленного белья и одежды при разных случаях насильственной смерти, а также всякого рода тряпки, нарочно пропитанные кровью во время производства судебных вскрытий. Кроме того, испытанию подвергались испачканные кровью деревянные предметы, разного рода камни, пропитанный кровью песок и кровяные пятна на штукатурке. Весь кровяной материал сохранялся без каких-либо мер предосторожности, и каждое пятно подвергалось определению по нескольку раз в различные промежутки времени. Штукатурка и пропитанный кровью песок все время находились на полном свету, иногда на солнце.

Что касается техники, то она в общем производится согласно указаниям творца метода, проф. Л. Ляттес. Описание ее постараюсь дать более подробно, так как, насколько мне известно, на русском языке такого описания еще нет, а между тем буквально все мелочи здесь являются чрезвычайно важными для получения правильных результатов. Техника состоит в следующем:

Из пропитанной кровью материи вырезается кусочек, величиной около 3—4 кв. см. Выбирается место наиболее пропитанное кровью. Кусочек этот ножницами перерезается по возможности мелко, а затем все это тщательно перетирается в фарфоровой ступке до состояния пыли. Берется маленькая пробирка размерами 4 1/2—5 см. длины и около 1 см. в диаметре и наполняется на 2/3 растертым в ступке кровяным материалом, при чем надо следить, чтобы содержимое в пробирке не было очень плотно спресовано и чтобы оно могло легко пропитаться сывороткой (а£), которую сейчас же и приливают. Указать точно, сколько надо прилить сыворотки, конечно, нельзя. Это уясняется только путем практических упражнений. Можно только дать такой руководящий совет: приливать сыворотки вообще возможно меньше, чтобы содержимое в пробирке пропиталось ею, но не больше. Пробирка закупоривается и ставится на холод (около 0°) на несколько часов, лучше всего на ночь. Утром можно удостовериться, произошла ли абсорбция. Делается это так: содержимое в пробирке при помощи подходящей стеклянной палочки сильно сжимается так, чтобы выжать из него 1—2 капли прилитой раньше сыворотки, и в то же время капли эти собираются тонкой капиллярной пипеткой и переносятся в другую, более маленькую пробирку, которая подвергается центрифугированию, чтобы осадить все мешающие исследованию посторонние волокна и частицы; наконец, уже просветленная сыворотка исследуется свежими кровяными тельцами А и В общеизвестным способом в висячей капле в влажной камере при температуре 20—25°.

Из сказанного видно, что техника очень несложна, но тем не менее считаю необходимым сделать некоторые разъяснения. Прежде всего не надо думать, что всегда увидим картину полной абсорбции, т. е. ясную реакцию с одним видом эритроцитов и совершенное отсутствие ее с другим. Это будет только тогда, когда сыворотки было прилито как раз столько, сколько надо. Если же был прилит некоторый излишек ее, то имеющийся в кровяном материале антиген не будет в состоянии поглотить целиком все антитела. Останется некоторое неиспользованное количество их, которое и может дать картину реакции, по большей части уже в более слабом, замедленном виде. Подобное явление всегда должно служить указанием на неправильность техники, на слишком большое количество прилитой сыворотки. Чтобы убедиться в этом и вместе с тем исправить ошибку, поступают так: в ту же самую пробирку, где находится кровяной материал, снова добавляют некоторое количество его и весь опыт повторяют сначала.

Одинаково надо всегда поступать и в тех случаях, когда окажется, что сыворотка совершенно не изменилась, т. е. она дает ясную реакцию с обоими видами эритроцитов. Делается это для того, чтобы убедиться, что кровь действительно в данном случае не содержит антигенов и, стало быть, при­ надлежит к группе 0αβ, и что технической ошибки здесь нет.

Отсюда вытекают два, на мой взгляд, очень важные в практическом отношении совета: перед опытом сыворотку необходимо всегда проверять на оба вида эритроцитов (А и В) и таким образом убеждаться, что, во-первых, она не испорчена, а во-вторых, ознакомляться с ее силой. Кроме того полезнее всегда брать сыворотку именно αβ, но не смесь α + β, как это предлагает, напр., Шиф. Дело в том, что исследователь, не имея под руками боль­ шого выбора сывороток, может встретиться с резкой разницей в силе агглютинации отдельных сывороток. В сыворотке же αβ, хотя антитела распределены также не поровну, но разница эта повидимому всегда небольшая.

Проделав большое количество опытов указанным методом, я пришел к заключению, что он, несомненно стоит выше всех остальных. По своей демонстративности, ясности и, так сказать, красоте он не оставляет желать ничего лучшего. Срок давности пятна (конечно, сроки не фантастические), повидимому, особой роли не играет. Мне постоянно одинаково легко удавалось производить анализ, как на сравнительно свежих пятнах, так и давностью в 1/2 года (пятен большей давности у меня не было). Но несомненно, что срок этот может быть еще удлинен. Так, напр., сам Ляттес сообщает, что ему удавалось получать результаты при давности в 15— 18 месяцев, что, конечно, удовлетворяет требованиям судебной практики. За небольшими исключениями одинаково легко удается обработка всех материалов, испачканных кровью. Здесь полезно указать, что все ткани обрабатываются, как указано выше. Кровь с дерева не срезается в виде тонких щепочек и стружек, но непременно соскабливается черепком скальпеля в виде порошка. To-же самое относится к штукатурке, камням и т. п. Труднее удаются опыты с кровью на сильно пористых строительных известковых камнях, каких, к несчастью, так много в Одессе. Здесь трудно выскоблить достаточное количество кровяного порошка, не наскоблив в то же время большого количества совершенно ненужного и сильно мешающего работе известняка. Но и в этих обстоятельствах при терпении можно преодолеть все.

Единственный случай, когда метод абсорбции не может быть применен с самого начала, это тот, когда кровяное пятно настолько мало, что мани­ пулировать с ним физически невозможно. Но на практике подобные случаи вряд ли имеют место. В крайнем случае можно попытаться применить описанные в моей работе методы «с покровным стеклышком» или метод «перевода крови».

Как уже упомянуто выше, метод избирательной абсорбции допускает контрольный опыт, что в нашей практике, конечно, является делом первостепенной важности.

Теоретическое обоснование для постановки опыта следующее: известно, что соединение антигена с соответствующим антителом не является связью стойкой. При температуре около 30° эта связь начинает разрушаться (Absprengung), и разрушение это достигает своего maximum’a при температуре в 45°. Стало быть, подвергнув «истощенную» сыворотку в течение некоторого времени действию температуры в 45°, мы снова превратим ее, так сказать, в первобытное состояние, что и обнаружится при испытании ее эритроцитами А и В. Отсюда вывод, что наблюдавшееся ранее исчезновение антитела (или обоих) в сыворотке надо объяснить ничем иным, как только фактом связывания с соответствующим антигеном.

Этот контрольный опыт уже значительно деликатнее и сложнее. Производится он следующим образом: в ту же самую пробирку, где находится кровяной материал, после его испытания на абсорбцию (см. выше) добавляется свежая порция сыворотки αβ, при чем количество добавленной сыворотки уже никакой роли не играет — пробирка просто наполняется почти до верха. Делается это для того, чтобы находящийся в кровяном материале антиген ad maximum мог нагрузиться соответствующим антителом и чтобы тем большее количество его (антитела) было отдано обратно при последующем разрушении этой связи. Далее, как и первоначально, закупоренная пробирка ставится на холод, а затем при низкой же температуре кровяной материал основательно и несколько раз промывается физиологическим раствором для удаления чсей прилитой раньше сыворотки. Удалить сыворотку необходимо потому, что теперь уже при заведомом избытке ее наверное останется значительная часть свободного, несвязанного антитела. В результате этих операций у нас в пробирке имеется кровяной материал, содержащий антиген, связанный до отказа с соответствующим антителом. Вместо же сыворотки имеется незначительное количество физиологического раствора. Если его очень мало, и не удается выжать палочкой нужные для реакции 1—2 капли, то раствор добавляется, конечно, в минимальном количестве. Подвергнув теперь эту пробирку действию температуры в 45° в течение 20 минут, мы разрушаем связь, переводим освободившееся антитела в физиологический раствор, собираем его пипеткой, как описано выше, центрифугируем и исследуем наличность освободившегося антитела соответствующим видом эритроцитов. В результате будет обратная картина: мы получим ту реакцию, которая отсутствовала в первоначальном опыте, и не получим той, какая была. Надо только помнить, что в результате всех этих манипуляций картина реакции, благодаря мельчайшим погрешностям в технике, иногда не будет такой быстрой, как мы обычно привыкли видеть.

Здесь также необходимо сделать несколько существенных добавлений. Промывание физиологическим раствором кровяного материала надо непременно делать на холоду весьма тщательно, иначе может остаться известное количество сыворотки, которая сама по себе впоследствии даст реакцию и этим совершенно спутает картину. Убедиться, что сыворотка отмыта хорошо, можно путем испытания оставшегося физиологического раствора обоими видами эритроцитов. Реакции не должно получиться никакой. Промывание я делаю так: химический стаканчик набивается снегом, в снег ставится пробирка, и в таком положении производится промывание. Конечно, можно употреблять и лед, хотя работа с ним вообще очень неудобна. Мне кажется, что все это можно заменить каким-либо подходящим охлаждающим раствором, но личного опыта у меня нет, так как не было времени заняться вопросом.

Далее, при испытании физиологического раствора после разрушения связи антиген-антитело уже нельзя пользоваться эритроцитами в виде 2—2,5% эмульсии, как это обыкновенно делается. Дело в том, что, упо­ требляя эмульсию, мы неизбежно вносим в физиологический раствор с появившимся в нем антителом значительное количество воды и тем самым сильно ослабляем агглютинирующее действие антитела. Поэтому, несмотря на присутствие его, реакции может не получиться. Отсюда следует, что надо пользоваться эритроцитами, не внося в то же время никакой посторонней жидкости. Я принужден был выработать собственный прием для этого, так как в работе проф. Ляттес указаний на этот счет нет никаких. Делается это так: приготовляют довольно крепкую эмульсию эритроцитов, центрифугируют; осевшие кровяные тельца два раза промываются физиологическим раствором. После последнего центрифугирования раствор осторожно отсасывается капиллярной пипеткой, насколько возможно. Далее, платиновой петлей набирается капелька из осадка и ударом пальца по стеклянной ручке петли совершенно стряхивают всю капельку. Остается, повидимому, пустая петля. На самом же деле на ней еще есть вполне достаточное количе­ ство эритроцитов, которое и вносится в испытуемую каплю. Метод этот служит мне очень хорошо.

На основании произведенных мною многочисленных опытов считаю возможным притти к следующим выводам:

1. Метод избирательной абсорбции по своей технике не представляет каких-либо особенных трудностей и доступен каждому, кто привык вообще к работе в лаборатории. Каких-либо особых приспособлений, кроме обычной обстановки, не требуется.
2. Область его применения шире прочих методов.
3. Давность образования кровяного пятна, а также и другие условия, при которых оно образовалось (напр., температура), повидимому, особенной роли не играет.
4. По силе своей доказательности метод должен быть поставлен выше всех остальных.
5. Метод не может быть применен с самого начала только при исключительно небольших по своим размерам пятнах.

Основная литература, с которой необходимо ознакомиться каждому, желающему изучить вопрос, приведена в моей указанной выше работе.

В заключение должен указать, что штандартные сыворотки, которыми я пользовался, приготовлялись мной самим исключительно из трупного материала. Вопросу этому в ближайшем будущем надеюсь посвятить отдельную работу. В настоящее время сыворотки эти производятся мной, совместно с ассистентом кафедры хирургии, д-ром М. С. Лейчик, в значительных количествах. Каждому интересующемуся они могут быть высланы.

¹ Юбилейный сборник, посвященный проф. патол. анатомии Одесск. Мед. Инст. М.М. Тизенгаузену по поводу 25-ти летия его деятельности.