К методике обнаружения агглютиногена Rho(D) в кровяных пятнах

В числе изосерологических систем, используемых в судебно-медицинской экспертизе, основное место занимают хорошо изученные агтлютиногены систем АВО и MN. Однако нередко полученные результаты исследования крови на вещественных доказательствах не разрешают вопросов, поставленных следствием, и тогда использование других агглютиногенов крови позволит расширить индивидуальную характеристику последней.

Среди «новых» агглютиногенов крови, описанных в литературе за последние 20 лет, одно из первых мест отводится агглютиногенам Rh0 (D), rh' (С), rh" (Е) и rh (cde), входящим в изосерологическую систему резус. Наибольший же практический интерес представляет аг- глютиноген Rh0, присутствующий в эритроцитах около 85 % людей.

Помимо эритроцитов, агглютиноген Rh0 содержится в клетках тканей и органов и в выделениях человеческого организма [Бурман (Boorman) и Додд (Dodd), П.Н. Косяков, Сломска (Slomska) и др.].

Возможности использования агглютиногенов резус в экспертизе пятен крови изучены недостаточно.

В отечественной и иностранной литературе до недавнего времени существовало мнение, что агглютиногены системы резус полностью теряют свою абсорбционную способность в высохшей крови. Так, П. Н. Косяков и М. А. Умнова (1950), применявшие метод абсорбции с гетеро- и изоиммунными сыворотками анти-резус на холоду, считают, что под влиянием высыхания агглютиноген Rho переходит в неактивное состояние и поэтому определение его в пятнах крови невозможно.

Аналогичные указания имеются в судебно-медицинских руководствах Грэдуолла (Gradwohl, 1954), Хансена (Hansen, 1954), Гонзалеса (Gonzales, 1954), Симонена (Simonin, 1955) и в трудах зарубежных серологов— Винера (Wiener, 1954), Дара (Dahr, 1954), Уитби (Whitby, 1953) и др.

Только в работах Рюфье и Дюко (Ruffie, Ducos, 1952, 1954) и Брокке (Brccke, 1954) сообщены положительные результаты обнаружения агглютиногенов системы резус в пятнах крови с .14—27-дневным сроком хранения. Эти авторы использовали абсорбционный метод при температуре + 4° в рефрижераторе (Брокке) и при +37° на водяной бане (Рюфье и Дюко), однако они не приводят подробно методику исследования.

Задачей настоящей работы являлось выяснение возможности определения агглютиногена Rh0 в пятнах крови и разработка методики его обнаружения в судебно-медицинской практике.

Материалом для исследования являлась кровь доноров и 'больных. В основном наши опыты относились к агглютиногену Rh0 и для контроля были испытаны несколько образцов крови с агглютиногенами rh' и rh".

Мы применили реакцию абсорбции в количественной модификаций, разработанную М. А. Бронниковой для определения агглютиногенов системы АВО в пятнах крови. Определяя агглютиноген Rho, мы несколько видоизменили методику, что дало возможность изучить абсорбционную способность этого агглютиногена в зависимости от условий и срока хранения.

Использовались сыворотки анти-резус, полученные в изосерологиче- ской лаборатории Института переливания крови, содержащие смесь полных и неполных резус-антител анти-Rho (D) или анти-Rho' (DC) достаточно высокого титра. Эти сыворотки хранили при температуре —10° и перед опытом разводили обычной сывороткой одноименной группы до требуемого титра.

Не все сыворотки анти-Rho или анти-Rho' оказались пригодными для реакции абсорбции. Из 13 испытанных сывороток, содержащих как неполные антитела, так и смесь полных и неполных резус-антител могли быть использованы только пять. Эти сыворотки отличались высокой специфичностью и давали отчетливую агглютинацию эритроцитов Rho в пробирках и на чашках Петри. Кроме того, неполные антитела,, содержащиеся в указанных сыворотках, обусловливали положительный результат непрямой реакции Кумбса.

Стандартные эритроциты Rh0 группы 0(1) брали у одного и того же донора.

Было исследовано 100 образцов крови в пятнах на наличие агглютиногена Rh0.

Кровь наносили на хлопчатобумажную ткань, марлю, батист, шелк, капрон, клеенку, сукно, бумагу и стекло (чашки Петри) и высушивали при комнатной температуре. Пятна крови на тканях помещали в бумажные пакеты, а кровь со стекла соскабливали, растирали в фарфоровой ступке я высыпали во флаконы из-под пенициллина. 75 пятен хранили в темном сухом месте, а 25 — на свету.

Исследования проводили через 2, 7, 14, 25, 36, 45, 60 и более суток после нанесения крови на предмет-носитель.

Ткань из пятна и контрольный участок предмета-носителя измельчали ножницами, готовили навески по 50 мг и помещали в пробирки- К 50 мг материала пятна или к 30 мг высохшей крови добавляли 0,3 мл сыворотки анти Rh0.

Реакцией абсорбции в двух вариантах исследовали 25 пятен крови Rh0. В первой серии опытов кровь испытывали сывороткой анти-Rho с наличием неполных (белковых) антител с титром 1 : 32. Абсорбцию проводили при температуре +4 ° в течение 24 часов. Во второй серии опытов применяли сыворотку анти-Rho с наличием полных (солевых) антител с титром 1:12. Абсорбцию проводили при +37° в течение 2—5 часов (в зависимости от характера и давности пятна). Для контроля одновременно исследовали пятна крови rh, rh', rh", предмет-носитель и исходную сыворотку анти-Rho. Во время абсорбции содержимое каждой пробирки несколько раз перемешивали.

По окончании абсорбции сыворотку отсасывали и центрифугировали. Учет результатов реакции производили путем развернутого титрования исходной и абсорбированной сывороток.

В первой серии опытов ( + 4°) абсорбированную сыворотку анти- Rho исследовали «конглютинационным» способом. Разведение сыворотки осуществляли каплями в чашках Петри в геометрической прогрессии обычной сывороткой группы АВ (от 1:2 до 1:64). К 2 каплям разведенной сыворотки прибавляли каплю 10% взвеси стандартных эритроцитов Rh0 в собственной сыворотке. Чашки Петри помещали в водяную баню при +45° на 10 минут. О связывании антител сыворотки агглютиногеном Rh0 крови мы судили по снижению первоначального титра абсорбированной сыворотки анти-Rho. Наличие 3 и более ступеней ослабления титра сыворотки, определяемых невооруженным глазом, свидетельствовало о присутствии агглютиногена Rh0 в пятне и, наоборот, в случаях, когда тигр абсорбированной сыворотки оставался 'Неизмененным, кровь в пятне рассматривалась нами как несодержащая антиген Rh 0 (табл. 1).

Таблица 1

Результаты титрования сыворотки анти-Rho, абсорбированной агглютиногеном Rh0 , крови пятна при температуре +40

Во второй серии опытов ( + 37°) абсорбированную сыворотку анти- Rho исследовали «солевым» методом в пробирках. Сыворотку разводили физиологическим раствором в арифметической 'прогрессии от 1:2 до 1 : 14. Пробирки, пастеровские пипетки и физиологический раствор перед употреблением подогревали. Титрование абсорбированной сыворотки производили стандартными Rho эритроцитами в виде 2% взвеси в физиологическом растворе; к 2 каплям сыворотки прибавляли каплю эри- троцитов.

Пробирки с разведенной сывороткой и стандартными эритроцитами помещали в водяную баню ( + 37°) на 1 — 1 1/2 часа, после чего центрифугировали при 1000 об/мин. Результаты читали .невооруженным глазом по агглютинации во всех разведениях после небольшого встфяхивания пробирок.

Выявление не менее 3 ступеней снижения титра сыворотки указывало на наличие в кровяном пятне агглютиногена Rho (табл. 2) .

При сравнении результатов исследования 25 пятен крови получены следующие данные: реакцией абсорбции при температуре +4 ° агглютиноген Rh0 выявлялся в пятнах до 2-недельной давности. Так, в 23 из 25 пятен получен положительный результат, а в 2 — сомнительный. После

2-недельного срока хранения пятен агглютиноген Rh0 был нами обнаружен в половине опытов. Через 3 недели кровь в пятне теряла способность абсорбировать анти-Rho антитела из сыворотки.

Абсорбция при +37° во всех 26 пятнах 2-недельной давности позволял а выявить агглютиноген Rh0 более отчетливо, чем при абсорбции на холоду (4—5 ступеней поглощения). К концу 3-й недели хранения абсорбционная способность агглютиногена Rh0 снижалась до 3 ступеней. В пятнах 4-недельной давности агглютиноген Rho был выявлен в 19 из

25 образцов крови. При хранении до 6 недель агглютиноген Rh0 открывался в 1/з исследованных пятен, а в более поздние сроки — в единичных случаях.

Таблица 2

Результаты определения агглютиногена Rh0 (D) в пятнах крови методом абсорбции (при температуре + 37°) в комбинации с антиглобулиновой пробой Кумбса

Предмет-носитель, кровь rh, rh' и rh", включавшиеся в опыт в качестве контроля, иногда давали снижение титра сыворотки на одну ступень поглощения. Исходная сыворотка анти-Rho не изменяла своего первоначального титра (см. табл. 2) .

Таким образом, реакция абсорбции при температуре +37° для определения агглютиногена Rho в пятнах крови является значительно более чувствительной, чем абсорбция «а холоду.

В целях дальнейшего усовершенствования методики обнаружения агглютиногена Rh0 в пятнах крови (сомнительные случаи), а также выявления его в пятнах большей давности мы дополнили абсорбционный метод при температуре +37° непрямым антиглобул иновым тестом Кумбса.

Непрямая реакция Кумбса применялась М. А. Бронниковой (1957) для выявления агглютиногена Келл в пятнах крови, -причем использовалась комбинация реакции абсорбции и пробы Кумбса для установления фактора Келл в пятнах однодневной давности.

М.А. Умнова, Д.С. Геллер и Л.Ф. Ваксман (1956) устанавливали резус-принадлежность эритроцитов свежей крови больных по антиглобулиновой сыворотке.

В наших исследованиях антиглобулиновая сыворотка применялась для определения неполных антител в абсорбированной сыворотке из разведения 1:14, при котором полные антитела уже не выявлялись.

Абсорбированную кровью пятна сыворотку, разведенную в 14 раз, отсасывали, оставшиеся эритроциты трижды отмывали подогретым физиологическим раствором. К отмытым эритроцитам добавляли каплю антиглобулиновой сыворотки, затем смесь центрифугировали в течение минуты и осадок просматривали с лупой, при хорошем освещении после легкого встряхивания пробирки (см. табл. 2).

В сыворотке анти-Rho, разведенной в 14 раз, действие полных антител не проявлялось, в то время как высокочувствительная проба с антиглобулиновой сывороткой устанавливала реакцию неполных антител,.

Агглютинация «сенсибилизированных» эритроцитов обнаруживалась к 5—10 минутам при наличии в пятне крови rh, rh' или rh". Аналогичные результаты дали контроль предмета-носителя и исходная сыворотка. Агглютиноген Rh0 в свежем пятне абсорбировал как полные, так и неполные антитела анти-Rho из сыворотки. Поэтому «сенсибилизации» стандартных эритроцитов не наступало и проба Кумбса была отрицательной. При ослаблении агглюгиногена Rh0 в старом пятне титр сыворотки анти-Rho снижался лишь на 1—2 ступени, что не позволяло сделать вывод о присутствии агглютиногена Rh0. Между тем проба Кумбса показывала истощение сыворотки анти-Rho (см. табл. 2) .

Нашими исследованиями установлено, что с увеличением срока хранения кровяного пятна свыше 3 недель или при наличии в свежем пятне агглютиногена слабого титра реакция абсорбции полных антител не всегда дает отчетливые результаты. Эти результаты могут быть дополнены или уточнены проведением антиглобулиновой пробы.

При помощи абсорбционно-тепловой методики и пробы Кумбса было исследовано 75 образцов крови в пятнах. В 4 образцах со сроком недельной давности агглютиноген Rho удалось обнаружить только пробой Кумбса. В остальных случаях агглютиноген Rh0 был установлен обоими способами.

Результаты исследования зависели от исходного титра агглютиногена Rh0 и от срока хранения пятен. Агглютиноген Rho крови в пятнах в 50.случаях имел высокий титр, в 21 — средний и в 4 — слабый.

Агглютиноген Rh0 высокого титра всегда обнаруживался при сроке хранения, равном месяцу, и в половине случаев— до 1 1/2 месяцев.

К 2 месяцам агглютиноген Rh0 утрачивал абсорбционные свойства и только в 3 случаях он был выявлен в пятнах 21/ -месячной давности. В пятнах крови со слабым титром агглютиногена Rh0 последний выявлялся только в срок не более недели.

Наилучшие результаты абсорбции получены с пятнами, хранившимися в темном сухом месте.

Выводы

1. Агглютиноген Rh0 в пятнах высохшей крови установить возможно.
2. Наилучшим способом обнаружения агглютиногена Rho в пятнах следует считать метод абсорбции при +37° в сочетании с непрямой антиглобулиновой пробой.
3. Абсорбционная способность агглютиногена Rh0 зависит от высоты его титра и от давности кровяного пятна.
4. Приведенная выше методика позволяет определить агглютиноген Rh0 в пятнах со сроком хранения до месяца. В более поздние сроки этот агглютиноген не всегда может быть выявлен.
5. Возможность выявления агглютиногена Rho в сухой крови может быть использована в судебномедицинской практике.