Выявление и исследование в сыворотках людей антител к агглютиногенам Р, S, Le, Lu, К, Fy

Наряду с изготовлением разных видов иммунных сывороток: преципитирующих и гемагглютинирующих, применяемых в судебномедицинской практике, сывороточный отдел Института судебной медицины приступил к изготовлению новых видов сывороток, получение которых позволит намного расширить границы судебномедицинской экспертизы крови и приблизить решение вопроса индивидуальной диагностики организма человека.

Над проблемой индивидуальной групповой характеристики человеческого организма уже давно работают многие исследователи.

За последнее десятилетие зарубежными учеными был обнаружен целый ряд новых антител в сыворотках крови больных, перенесших большое количество гемотрансфузий, в крови женщин, дети которых болели гемолитической желтухой, а также в крови некоторых доноров. Эти антитела большей .частью названы по фамилиям лиц, у которых они обнаружены. В эритроцитах соответственно антителам позже были найдены агглютиногены.

Уже насчитывается несколько новых изосерологических систем: Р, S, Льюис, Лассеран, Келл, Даффи, Кидд и др. (Lewis, Lusseran, Kell, Duffy, Kidd). Эти системы»самостоятельные, не зависящие от систем ABO, MN, Rh, за исключением S, которая входит в изосерологи- ческую систему MN, и Келл, связанную с системой Резус. Разное сочетание агглютиногенов в крови у каждого человека имеет большое значение для диагностики крови, и в судебной медицине оно- может оказать помощь в расследовании некоторых преступлений.

Вопрос о необходимости изучения систем крови, выходящих за пределы систем AB0, MN, Ph, в Советском Союзе впервые поставила в Институте судебной медицины в 1956 г. М. А. Бронникова с сотрудниками; В. А. Багдасаров, Л. О. Барсегянц и Т. М. Масис выявили ряд агглютиногенов в жидкой и сухой крови.

Чтобы подойти к изучению этих новых для нас факторов, необходимы были соответствующие сыворотки, которых до сих пор в СССР не изготовляли.

Мы приступили к работе в конце 1956 г. Исследования производились с полученными из зарубежных стран очень незначительными количествами сывороток, что заставило нас ограничиться исследованием крови небольшого числа лиц. Впоследствии, обнаружив в сыворотке одного больного агглютинины анти-Р и приготовив анти-Р сыворотку с достаточным для работы титром, мы определяли фактор Р в крови лиц, сыворотку которых изучали на наличие анти-Р антител. В связи с этим большинство образцов крови, помимо определения групповой и типовой принадлежности, исследовали на содержание агглютиногена-Р.

После изучения методики и техники определения факторов крови, выходящих за пределы систем AB0, MN, Rh, было исследовано 790 образцов жидкой крови, полученной от разных доноров и больных, перенесших неоднократные гемотрансфузии.

Кровь эта в дальнейшем частично была использована для идентификации и абсорбции исследуемых сывороток.

Присутствие в эритроцитах агглютиногенов Р, Льюис (а + ), Льюис (в + ), Лассеран (а + ), S устанавливалось в солевой среде с помощью реакции агглютинации при разных температурах — от 4 до 37°. Факторы Келл и Даффи определялись непрямой реакцией Кумбса (Coombs).

В результате были выявлены доноры, имеющие те или иные факторы, чтопозволилоустановить частотуобнаружения этих факторов. Полученные результаты близки к данным, приведенным большинством авторов (табл. 1).

Определение агглютиногенов в эритроцитах крови доноров предшествовало основной и наиболее трудной задаче — изготовлению стандартных сывороток путем выявления нормальных и изоиммунных антител в сыворотках людей.

Таблица 1

Определение агглютиногенов в эритроцитах крови человека

Из литературных данных известно, что в сыворотках здоровых лиц очень редко можно обнаружить антитела к агглютиногенам, не входящим в системы AB0. MN и Rh. Однако среди этих антител относительно часто выявляются агглютинины анти-Р. Учитывая большую доступность получения сывороток от здоровых лиц и принимая во внимание литературные данные, мы начали поиски антител анти-Р в нормальных сыворотках. В процессе работы сочли целесообразным исследовать каждую сыворотку не только на наличие в ней анти-Р, но и других агглютининов, которые еще реже встречаются в нормальных сыворотках.

Всего было исследовано 1468 сывороток. Большая часть их (1382) получена от здоровых доноров Московской городской станции переливания крови и Московского института эпидемиологии, микробиологии и гигиены. Часть сывороток (80) была получена из крови больных, страдающих болезнями крови, злокачественными опухолями, волчанкой, т. е. больных, подвергавшихся неоднократным гемотрансфузиям. Небольшое число образцов крови (6) получено от рожениц, которые в прошлом имели детей, больных гемолитической желтухой, и мертворожденных. Как и следовало ожидать, исследование крови больных, имевших в прошлом многократные гемотрансфузии, позволило выявить значительно большее число лиц с содержанием тех или иных антител, чем крови здоровых. Однако получить от этих лиц достаточное количество крови для приготовления сывороток не представлялось возможным ввиду тяжести их заболевания.

Присутствие агглютининов анти-Р, анти-S, анти-Le (а + ), анти-Le (в + ) и анти Lu (а + ) устанавливалось в пробирках реакцией агглютинации соответствующих стандартных эритроцитов с испытуемой сывороткой при оптимальных для каждого антитела температурных условиях. Агглютинины анти-Келл и анти-Даффи как, неполные антитела выявлялись непрямой реакцией Кумбса. Реакция эта трудоемкая, и результаты не .всегда получались четкими вследствие наличия агглютинации эритроцитов в виде монетных столбиков. Впоследствии определение неполных антител производилось >в коллоидной среде «биогель» путем добавления к испытуемой сыворотке стандартных эритроцитов с оксалатом натрия. Результаты оказались более четкими.

Таким образом, каждая сыворотка исследовалась с 8—12 стандартными эритроцитами. Постановка реакций велась при следующих температурах: 4°, 12°, 15°, 18°, 25° и 37°. Для выявления агглютининов к агглютиногенам одной изосерологической системы применяли не менее 4—6 положительных и 2—4 отрицательных стандартных эритроцитов каждого фактора крови.

Основные трудности исследования заключались, во-первых, в малых количествах испытуемых сывороток, получаемых от больных, вследствие чего эти сыворотки не могли быть полностью исследованы на наличие всех агглютининов, во-вторых, в недостаточном количестве доноров разных групп, имеющих агглютиногены Лассеран и Келл, вследствие чего не все сыворотки могли быть подвергнуты соответствующему изучению.

Итак, изучение сывороток на содержание в них различных антител, не входящих в системы AB0, MN, Rh, мы начали определением агглютининов анти-Р. Антитела анти-Р, как известно, встречаются в сыворотках Р-отрицательных людей как нормальные холодные агглютинины низкого титра. Однако имеется небольшое число людей, у которых антитела анти-Р являются активными при 37°, они могут служить причиной посттрансфузионных реакций и иногда вызывать гемолитическую желтуху новорожденных [Винер, Муро (Wiener, Moureau)].

О частоте обнаружения агглютининов анти-Р в нормальных сыворотках людей имеются различные данные, однако все авторы отмечают, что антитела анти-Р достаточно высокого титра встречаются крайне редко [Хеннингсен (Henningsen)]. Так, например, Хунтгебурт (Hunt- geburth), исследуя 3000 сывороток, ни в одном случае не нашел указанных агглютининов высокого титра. Дару (Dahr), изучавшему примерно такое же количество сывороток, удалось обнаружить лишь одну сыворотку анти-Р, обладавшую достаточным для работы титром.

Первоначально выяснялась возможность обнаружения вышеуказанных антител в сыворотках здоровых лиц — доноров.

Вначале сыворотки исследовали только на наличие агглютининов анти-Р, впоследствии они одновременно изучались на наличие и других антител. Для выявления анти-Р-антител всего нами было исследовано 900 таких сывороток. Позже, когда была выявлена одна сыворотка анти-Р о титром 1:18, прежде чем искать антитела анти-Р в каждой сыворотке, определяли фактор Р в эритроцитах данной крови и затем искали антитела анти-Р только в сыворотках P-отрицательных лиц.

Учитывая, что агглютинины анти-Р в большинстве случаев являются холодными, выявление их начиналось обычно после абсорбции неспецифических холодных антител (по Хеннингсену) Р-отрицательными эритроцитами. К испытуемой сыворотке добавляли полобъема ОР-отрицательных эритроцитов и оставляли в течение 18—20 часов при 4°. Затем при той же температуре ставили реакцию агглютинации, для чего в пробирку с каплей абсорбированной сыворотки помещали каплю 2% взвеси ОР-положительных, в другую пробирку — каплю той же сыворотки с каплей 2% взвеси ОР-отрицательных эритроцитов. На другой день реакция учитывалась под микроскопом. При получении положительного результата определялся титр антител. Титрование проводили с 2% взвесью эритроцитов 0(1) группы, содержащих сильный, средний и слабый агглютиноген Р. В качестве контроля применяли ОР-отрицательные эритроциты.

Результаты проведенных исследований приведены в табл. 2.

В связи с тем, что часть исследованных сывороток происходила от лиц Oap(I), Ар(II) и Ва(Ш) групп крови и, следовательно, они содержали а- и р-изоагглютинины, от последних необходимо было освободиться. После абсорбции их сыворотки значительно снижали или совсем теряли титр антител анти-Р, что заставило нас впоследствии в основном исследовать сыворотки крови AB(IV) группы (без дополнительного агглютинина а), которые в положительном случае можно было бы использовать неабсорбированными. Считают, что применение сывороток с титром 1 : 8 не всегда дает правильные результаты и точность определения фактора Р увеличивается по мере увеличения титра антител, поэтому для работы применялись сыворотки с титром не ниже 1:16.

Таким образом, полученные результаты полностью подтверждают данные зарубежных исследователей о редких случаях нахождения агглютининов анти-Р, обладающих достаточно высоким титром, в сыворотках крови здоровых людей. Из 900 сывороток лишь 6 обладали антителами анти-Р с титром 1: 16—1: 32.

Что касается частоты обнаружения антител анти-Льюис, анти-Лассеран, анти-S и др., то можно указать на следующие цифры. Петтенко- фер, изучая 1763 сыворотки родильниц, в 19 обнаружил агглютинины анти-Льюис (а + ) и в 2-—анти-Льюис (в +). При исследовании 18 613 сывороток доноров лишь в 3 были выявлены агглютинины анти-Лас- серан. Антитела анти-Келл были найдены только в 8 случаях при исследовании 10 000 сывороток. Также крайне редко встречаются антитела анти-S и анти-Даффи.

Как известно, перечисленные антитела могут являться причиной гемолитических желтух новорожденных и при переливании крови могут вызывать посттрансфузионные реакции.

Продолжая поиски антител в испытуемых сыворотках, помимо исследования их на наличие антител анти-Р, в 605 сыворотках мы пытались выявить присутствие антител анти-Льюис (а + ) ив 588 — анти-Льюис (в + ). Эти антитела впервые были обнаружены Морантом (Mourant) в 1947 г. в сыворотке женщины, родившей ребенка, больного эритробластозом. Эти антитела могут быть отнесены к холодным с температурным оптимумом от 4 до 20°. Имеются и иммунные антитела, активные при 37°, а также и неполные. Грубб (Grubb) показал, что люди, обладающие агглютиногеном Льюис (a-j-), являются «невы- делителями» субстанций А, В и О и, наоборот, — Льюис (в+) «выделителями».

Кроме указанных антител, в 613 сыворотках определялись и агглютинины анти-S. Последние были открыты в 1947 г. Уолшем и Монтгомери (Walsh a. Montgomery), позже—Левиным (Levine) и др. обнаружены антитела анти-S в сыворотках женщин, имеющих детей, больных гемолитической желтухой. Пиккельс (Pfckels) считает антитела анти-S иммунными. Попытка получить соответствующие агглютинины от 61 донора, иммунизированных кровью группы MS, не увенчалась успехом.

В 620 сыворотках нами изыскивались антитела анти-Лассеран (а+ ). Они были найдены Каллендером и Рэйсом (Callender, Race) в 1946 г. в сыворотке больного волчанкой, которому неоднократно переливали кровь. Позже, Гринволтом и Сазаки (Greenwalt a. Sasaki) в крови больной, перенесшей посттрансфузионную лихорадку, были выявлены агглютинины анти-Лассеран (в + ), обладающие свойствами иммунных антител. Встречаются и нормальные агглютинины, активные при температуре 10—15°. Агглютинация характерная — наряду с крупными агглютинатами наблюдаются неагглютинированные эритроциты.

Испытывалось 570 сывороток на наличие агглютининов анти-Келл.

Последние найдены Кумбсом в 1946 г. у женщины, родившей ребенка с гемолитической желтухой. Сэнджер описывает случай появления агглютининов анти-Келл после трансфузии. Симмонс (Simmons) наблюдал, что в результате иммунизации II человек Келл ( + ) положительной кровью у 5 из них выработались антитела анти-Келл.

И, наконец, в 570 сыворотках определялись антитела анти-Даффи, которые были обнаружены в 1950 г. Катбушем, Моллисоном и Парки- ным (Cutbush, Mollison a. Parkin). Антитела анти-Даффи, как и анти-Келл, относятся к неполным агглютининам. В основном эти антитела иммунные и могут появляться после гемотрансфузий.

В результате проделанной работы по исследованию антител в сыворотках здоровых людей наши поиски лишь 1 в небольшом количестве случаев увенчались успехом.

Таблица 2

Определение антител в сыворотках крови здоровых людей

Как видно из табл. 2, из 900 сывороток, которые исследовались на наличие анти-Р-антител, лишь в 30 удалось обнаружить таковые, причем 16 из них обладали низкими титрами, у 8 сывороток титр колебался в пределах 1/8—1/12 и лишь 6 сывороток имели анти-Р-агглютинины высокого титра — от 1/16 до 1/32 В одном случае удалось обнаружить слабые анти-Le-антитела.

AHTH-Leb -агглютинины были выявлены в 11 сыворотках, титр 3 из них достигал высоты 1/8.

Малоуспешными оказались также поиски анти-Б-антител. Выявленные две сыворотки анти-S из 613 исследованных обладали очень низким титром.

В одной сыворотке из 620 были найдены также очень слабые анти^и-аититела. И, наконец, из 570 сывороток, исследованных на наличие антител анти-Келл и анти-Даффи, ни в одном случае не удалось обнаружить таковые.

Полученные данные полностью подтвердили указания зарубежных авторов о редких случаях наличия вышеуказанных антител в сыворотках здоровых людей, и заставили нас искать эти антитела в сыворотках больных лиц, которые подвергались неоднократным гемотрансфузиям.

Нам удалось получить 80 сывороток от таких больных. От исследования этих сывороток следовало ожидать в значительно большем количестве случаев выявления указанных антител. Эти предположения подтвердились.

Результаты исследований представлены в табл. 3, из которой видно, что из 80 полученных сывороток в 13 оказались анти-Р-антитела, из них две с высоким титром (1/16—1/32). В 3 случаях были обнаружены анти-Lea и в двух — aнти-Leb -агглютинины с высотой титра Vs. Четыре сыворотки обладали  слабыми антителами анти-S; две — содержали антики-агглютинины.

И в этих сыворотках, как и в сыворотках здоровых людей, ни разу не удалось обнаружить антител анти-Келл и анти-Даффи.

Как указывалось выше, кровь для исследования получали от больных в незначительных количествах; повторно взять кровь не представлялось возможным вследствие их тяжелого состояния.

Таблица 3

Мы пытались находить также указанные антитела в сыворотках крови рожениц, которые в прошлом имели детей, больных гемолитической желтухой, или мертворожденных. Мы располагали всего 6 такими сыворотками, из них лишь в одной удалось обнаружить анти-Р- антитела.

Итак, в результате проведенной работы было получено 8 сывороток ан- ти-Р с титром 1/16—1/32. Обнаруженные агглютинины анти-Лассеран (а + ), анти-S, анти-Лью- ис (а + ), анти-Льюис (в + ) и анти-Р в основном были очень низкого титра (от неразведенных до 1 : 4—1 : 8). Они были выявлены в сыворотках лиц, имеющих группы крови О, А и В, и требовали дальнейшей абсорбции а и β изоагглютининов. Удаление последних влекло за собой потерю найденных редких антител. Для практической работы эти сыворотки, за исключением сывороток анти-Р, оказались непригодными как очень слабые.

Работу в отношении поисков редких антител для приготовления соответствующих сывороток необходимо продолжить, но только в сыворотках больных, перенесших неоднократные гемотрансфузии. У таких больных вследствие изоиммунизации можно надеяться чаще найти интересующие нас редкие антитела.

Получение таких сывороток даст возможность судебномедицинским экспертам значительно расширить проведение экспертиз по исследованию вещественных доказательств и приблизиться к разрешению задачи по индивидуальной характеристике крови человека, что в свою очередь безусловно облегчит работу следственных органов в деле раскрытия преступлений.