К методике изготовления сывороток анти-Р (Сообщение 1-е)

Выявление все новых и новых групповых факторов крови, одним из которых является агглютиноген Р , должно привести к более точному дифференцированию крови и поэтому имеет большое значение при «проведении некоторых -видов судебномедицинской экспертизы. Однако для определения этих факторов необходимо иметь соответствующие сыворотки, которые до настоящего времени у нас не изготовлялись.

Вопросу приготовления одной из этих сывороток, а именно сыворотки анти-Р, и посвящена настоящая работа.

Изучение агглютиногена Р показало, что он может быть обнаружен при помощи нормальной или изоиммунной сыворотки человека.

Стандартные сыворотки высокого титра можно получить лишь в результате исследований большого количества сывороток людей [Кра и Хартер (Krah и Harter), Андрезен (Andresen), Л. К. Аржелас, Е. С. Лутчева, М. Н. Резникова, М. И. Потапов и Н. А. Соловьева]. Некоторые авторы [Хунтгебурт (Huntgeburth) s Дар (Dahr)], изучив по 3000 человеческих сывороток, не нашли ни одной, пригодной для практической работы. Поскольку считают, что при обнаружении агглютинина анти-Р в человеческой сыворотке речь идет о холодном агглютинине, при котором реакцию целесообразнее проводить при низкой температуре (2—6°) в холодильнике, а такие сыворотки с высоким титром встречаются исключительно редко, их нельзя было рекомендовать для практической работы.

Из литературных данных известно, что для обнаружения фактора Р лучше применять нормальные сыворотки животных. По Дару, нормальные сыворотки анти-Р лучше всего получать из крови лошадей и свиней. Шифф (Schiff), Блюменталь (Blumenthal) и Штоварсер (Sto- wasser) рекомендуют изготовлять сыворотки анти-Р из крови лошадей, Кра и Хартер, Юнгмихель (Jungmichel) —из крови свиней и рогатого скота. Однако сыворотки высокого титра и в этих случаях можно обнаружить крайне редко. Некоторые авторы [Кра и Хартер, Петруски (Pietrusky)] считают, что для наиболее точного выявления агглютиногена Р можно использовать иммунные сыворотки, полученные путем введения животным (кроликам, лошадям, морским свинкам) эритроцитов, содержащих агглютиноген Р. В сыворотках анти-Р, полученных Ландштейнером. (1928) при иммунизации кроликов, была обнаружена достаточная однородность реакции с сывороткой анти-Р человека и животных. Незначительные же отклонения обусловливались различием в титре и температурном режиме, при котором они действовали. Иммунные сыворотки удается получить с большим трудом. Ряд исследователей [Ландштейнер, Шруттон (Schrutton) и Чэз (Chase), Кра и Хартер, Диэс (Dies)] получили сыворотки анти-Р путем иммунизации кроликов, а Кра и Хартер также при помощи иммунизации морских свинок. Блюменталь и Штовассер также путем иммунизации людей и лошадей получили сыворотки анти-Р. Некоторые авторы [Нигг (Nigg). Шифф, Дар и др.] иммунных сывороток не получили.

Поскольку агглютиноген Р в крови различных людей выражен в неодинаковой степени, мы стремились получить сыворотки достаточно высокого титра, что диктуется требованиями практики.

Работу проводили в двух направлениях.

С одной стороны, были предприняты попытки получить нормальные сыворотки анти-Р от животных (свиней), с другой — гетероиммунные сыворотки (от кроликов и морских свинок).

Принимая во внимание, что агглютинин анти-Р встречается в виде нормального антитела в сыворотке различных животных, мы изучали сыворотки свиней с целью выявить в них нормальные агглютинины анти-Р. Для получения сывороток высокого титра были сделаны попытки установить оптимальные условия абсорбции, для чего испытывали наиболее пригодную продолжительность ее при разной температуре. В результате из 85 свиных сывороток было получено 10 сывороток с наличием агглютининов анти-Р низкого титра (1 : 2—1:4).

Таким образом, получить сыворотки анти-Р достаточно высокого титра от свиней не удалось.

Как было указано выше, такие сыворотки встречаются редко и для выявления их необходимо изучить значительно большее количество (несколько сотен) свиных сывороток.

Работа в этом направлении будет продолжена.

Поскольку некоторые зарубежные авторы считают, что только применение иммунных сывороток анти-Р может дать надежные результаты исследования агглютиногена Р, мы предприняли попытку получить гетероиммунные сыворотки анти-Р.

Сначала были иммунизированы морские свинки, которым вводили в вену по 2 мл 10% взвеси эритроцитов ОМ с сильно выраженным фактором Р в течение 4 недель с интервалами в 2 дня. На 7-й день после последней инъекции у свинок брали кровь из сердца. От каждой свинки было получено незначительное количество сыворотки (5—8 мл), которую абсорбировали и проверяли на стеклянной пластинке и пробирочным методом. Специфичных сывороток анти-Р получить не удалось.

В связи с тем что морские свинки тяжело переносят иммунизацию и от них можно получить лишь незначительные количества сыворотки, мы решили иммунизировать кроликов. Десяти кроликам вводили внутривенно 30% взвесь эритроцитов OMN с сильно выраженным агглютиногеном Р в первые 2 дня недели по 2 мл, а затем в связи с ухудшением состояния кроликов — по 1 мл. После 6 инъекций было произведено пробное кровопускание и проверка на наличие агглютининов анти-Р, которая дала отрицательный результат. Затем иммунизацию продолжали еще в течение 3 недель. Через 7 дней после последней инъекции у кроликов была взята кровь. Для проверки сыворотки разводили в 10 раз физиологическим раствором и абсорбировали, добавляя У-2—7% объема эритроцитов OMNP—. Лишь в сыворотке одного кролика был обнаружен агглютинин анти-Р, титр которого достигал ,1:4. Поскольку указанным методом не удалось получить ни одной сыворотки высокого титра, далее мы попытались получить их при помощи другого метода иммунизации. Десять кроликов иммунизировали 11 раз попеременно внутривенно и внутрибрюшинно с интервалами в 2 дня. Чтобы избежать образованию антител анти-N (кролики, как показал опыт, относительно редко отвечают выработкой агглютининов анти-М и более восприимчивы к антигену N), в данном опыте для иммунизации мы применяли эритроциты ОМ с сильно выраженным агглютиногеном Р.

В результате иммунизации у кроликов не выработались агглютинины анти-Р, поэтому их подвергли реиммунизации ОМР + эритроцитами троекратно в вену. Полученные сыворотки обрабатывали различными методами, однако выявить в них антитела анти-Р не удалось.

В следующей серии опытов, для того чтобы расширить диапазон антигенного действия, при иммунизации применяли Р+ кровь от 2 доноров попеременно: кровь одного донора ОМР + кровь другого — OMNP + , у которого агглютиноген М выражен сильнее, чем N.

У обоих доноров агглютиноген Р был сильно выражен. Иммунизировали 9 кроликов 6 раз в день при помощи внутривенных инъекций по 1 мл 10% взвесью эритроцитов в первый день, 20% —во второй и 50% взвесью —в пятый и шестой день. На седьмой день после последней инъекции у кроликов брали 30—40 мл крови. Для пробной проверки сыворотки разводили в 15 и 30 раз. К каждому разведению сыворотки добавляли эритроциты OMNP—: для первой абсорбции — Уа объема, для второй — 74 и для третьей — 1 /8 объема. Проверку производили пробирочным методом. Техника проверки сывороток состояла в смешивании 3 капель сыворотки с одной каплей 2% взвеси эритроцитов OMNP+ и OMNP—, после этого смесь оставляли при комнатной температуре на 2 часа, а затем центрифугировали в течение одной минуты. Результаты учитывали путем микроскопического исследования. Данные обработки этих сывороток отражены в таблице.

Результаты проверки иммунных кроличьих сывороток на наличие в них агглютининов анти-Р

Обозначения: +4—I—Ь реакция агглютинации, видимая макроскопически; +++ реакция агглютинации, видимая в лупу; -++- крупные конгломераты склеившихся эритроцитов, видимые под микроскопом; + более мелкие конгломераты на фоне несклеившихся эритроцитов, видимые под микроскопом; + - слабо выраженная агглютинация, видимая под микроскопом; - + отдельные очень мелкие конгломераты, состоящие из 3—4 эритроцитов, видимые под микроскопом; н/р — неразведанная сыворотка.

Как видно из таблицы, из неабсорбированных иммунных кроличьих сывороток, предварительно разведенных 1:30, после одной абсорбции удалось изготовить две сыворотки анти-Р, после двух абсорбций — одну, после трех — 3 сыворотки анти-Р. Из тех же иммунных сывороток, разведенных 1 : 15, после двух абсорбций изготовлены две сыворотки, после трех абсорбций — 4, после четырех — одна сыворотка с антителами анти-Р.

Полученные сыворотки анти-Р оказались неспецифичными — они агглютинировали эритроциты групп А и В, поэтому необходимо было их освободить от антител анти-А и анти-В, которые имелись в этих сыворотках в титре 1:2—1:8. Так как при абсорбции этих групповых антител в некоторой степени удаляется и агглютинин анти-Р, целесообразно было абсорбировать лишь те сыворотки, титр которых был не ниже чем 1 : 16. Для абсорбции антител анти-А и анти-В применяли кровь групп А и В типа MN в небольших количествах.

После такой абсорбции из 5 абсорбированных сывороток четыре стали специфичными с титром антител анти-Р 1:24—1:32, т. е. оказались пригодными для определения агглютиногена Р в крови. Сыворотка, титр которой до абсорбции групповых антител достигал 1 : 16, а после абсорбции снизился до 1:4, для дальнейшей работы оказалась непригодной. Таким образом, из 9 иммунизированных кроликов от 2 были получены сыворотки анти-Р высокого титра, из которых были приготовлены специфичные сыворотки, пригодные для практической работы. От 5 кроликов получены сыворотки с низким содержанием агглютинина анти-Р, из которых приготовить специфичные сыворотки достаточного титра не удалось. В сыворотках 2 кроликов антитела анти-Р не обнаружены.

После многих попыток удалось, наконец, получить специфичные иммунные сыворотки анти-Р достаточно высокого титра. Однако остается -неизвестным, существует ли индивидуальное различие в отношении антигенных свойств агглютиногена Р, так как в опытах при иммунизации мы пользовались только эритроцитами с сильно выраженным фактором Р.

Результаты нашей работы показывают, что кратковременная им- музация дает возможность получить специфичные сыворотки анти-Р. При длительной иммунизации кролики вырабатывают наряду с антителами анти-Р агглютинины анти-А, анти-В и анти-0 более высокого титра, при абсорбции которых удаляется также и агглютинин анти-Р.

Можно предполагать, что относительно небольшая восприимчивость кроликов к другим антигенам в такой короткий срок комбинируется с большей восприимчивостью для антигена Р.

Много еще не решенных вопросов в методике приготовления и проверки, а также сохраняемости сывороток анти-Р, которые требуют дальнейшего изучения и разрешения.

Выводы

1. Изготовление сывороток анти-Р из крови свиней является чрезвычайно затруднительным, так как в большинстве случаев агглютинин анти-Р имеет в них низкий титр.
2. Получение гетероиммунных сывороток анти-Р при помощи иммунизации морских свинок для практической работы нецелесообразно в связи с незначительным количеством получаемой от них сыворотки.
3. Гетероиммунные сыворотки анти-Р можно получить, иммунизируя кроликов эритроцитами человека с сильно выраженным агглютиногеном Р.