О применении микроспектрографии при экспертном установлении минимальных количеств крови

Установление наличия крови на вещественном доказательстве может не представлять особых затруднений. Однако еще нередко встречаются случаи, когда в формулировке ответа указывается: «крови не обнаружено». Это может означать, что крови на объекте вообще нет или же, что эксперт не в состоянии доказать ее присутствие. Поэтому одним из важнейших вопросов судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств остается вопрос о разработке методики и техники обнаружения минимальных количеств крови морфологическими, химическими, микрокристаллическими, флуоресцентными и спектральными методами.

Большинство отечественных экспертов считают наиболее чувствительным и убедительным спектральный метод. Его можно применять в виде микроспектроскопии объекта и (значительно реже) спектрографического исследования растворов крови в кюветах (А. И. Законов, 1945; М. А. Васильев, 1957; А. К. Туманов и А. А. Розанов, 1958, и др.). Первый метод позволяет визуально обнаруживать очень малые количества крови; второй требует большего количества исследуемого объекта, но зато оставляет эксперту объективное доказательство — спектрограмму.

Общий вид микроспектрографической установки.

Естественно, что наибольшую практическую значимость представляет соединение упомянутых вариантов спектрального анализа в единый микроспектрографический метод, описанный в технической литературе (В. А. Корчагин и Н. И. Зазыбин, 102Э; Е. М. Брумберг и Ф. М. Пекерман, 1949; А. А. Шишловский, 1951, и др.). Однако в доступных нам отечественных и иностранных работах по судебной медицине не удалось обнаружить конкретных рекомендаций по его применению при экспертизе вещественных доказательств. В связи с этим мы попытались использовать для этой цели высококачественные отечественные кварцевый и стеклянный спектрографы ИСП-28 и ИСЛ-61. Сочетанием соответствующих приборов и использованием дериватов гемоглобина, обладающих высокими абсорбционными качествами, мы стремились установить возможно меньшие количества крови.

Мы отказались от комбинирования упрощенной фотокамеры-при ставки с микроспектроскопической насадкой по следующим соображениям.

1. Полосы абсорбции при минимальных количествах крови всегда выражены нерезко, поэтому фотографирование спектра требует высококачественной щели прибора, значительной дисперсии призм, позволяющей точно определить максимумы полос поглощения, большой светосилы камеры, строгой фокусировки в плоскости эмульсии фотопластинки определенных участков спектра. Этим условиям удовлетворяют отечественные спектрографы, но не упрощенные насадки.
2. Обработка результатов исследования требует съемки в идентичных условиях на одной фотопластинке ряда абсорбционных и эмиссионных спектров, что лучше всего производить на спектрографе.
3. Упрощенные приставные фотокамеры к микроспектральным на садкам весьма редки и обладают низким качеством, высококачественные же спектрографы в настоящее время выпускаются в массовом количестве. Спектры абсорбции обычно состоят из полос поглощения, расположенных на фоне сплошного спектра. С уменьшением количества исследуемого вещества наблюдается постепенное ослабление абсорбционных полос, затем менее интенсивные из них становятся неразличимыми и остаются лишь наиболее выраженные. Наконец, перестает определяться последняя полоса, что соответствует пределу чувствительности метода. Применительно к крови это означает, что минимальные количества ее могут определяться одной весьма неясной полосой поглощения, которую далеко не всегда можно уверенно диагностировать.

Наиболее благоприятные условия для выявления полос абсорбции  производных гемоглобина получились в следующих, составленных на ми вариантах конструкции микроспектрографических установок.

Микроскоп М-10 с отклоненным до горизонтального положения тубусом располагался на подставке на рельсе спектрографа так, чтобы оптические оси обоих приборов совмещались (см. рисунок). Кюветы или капилляры с исследуемыми растворами крови устанавливались на предметном столике перед объективом микроскопа. Для капилляров, употреблялся специальный держатель в виде пластинки из органического стекла размером 30X20X5 мм с поперечным пазом на одной из длинных сторон размером 10X5 мм. В паз была вставлена резиновая прокладка с прорезью, перпендикулярной к плоскости пластинки. В указанную прорезь вставляли капилляр, а держатель прижимали зажимами к предметному столику микроскопа. Свет от электролампы (6,3 V), закрепленной в штативе ШТ-9, с помощью конденсора направлялся в осветительную систему микроскопа с удаленным зеркалом. Вращением винтов микроскопа достигалось отчетливое изображение поглощающего слоя на крышке объектива спектрографа и совмещалось с расположением щели. После снятия крышки объектива производили съемку спектров абсорбции при объективе микроскопа 8Х, окуляре 10Х, расстоянии от окуляра до объектива спектрографа 20 см,, размере щели 0,010X0.6 мм.

В процессе спектрографирования растворов постепенно убывающей концентрации выяснилось, что минимальный предел количества- крови перед щелью спектрографа, позволяющий установить ее присутствие в объекте при любых концентрациях раствора, представляет собой постоянную величину. Это позволило рассчитать и применить для анализа кюветы и капилляры весьма малого объема (см. таблицу).

Применение таких кювет для исследования раствора, приготовленного из высушенной крови в соотношении 1 :3000, позволило определять количества крови порядка 0,0025 мг, 0,002 мг, 0,0005 мг и 0,0001 мг, а применение капилляров дало возможность определить количество- крови порядка 0,001 мг, 0, 0007 мг, 0,00006 мг и 0,00001 мг.

Стремясь микроспектрографировать количества, меньшие указанных выше, мы производили исследования крови на предметном стекле. Визуальное исследование спектров поглощения хорошо знакомо экспертам, и мы хотели дополнить его фотографированием. В то же время для исследования обычно поступают сухие пятна, похожие на кровь, или соскобы с подозрительного пятна. В таком случае растворение объекта нежелательно, во-первых, потому, что может произойти потеря части объекта (вследствие неполного растворения пятна), во-вторых, это* связано с кропотливым манипулированием с весьма малыми объемами жидкости, что представляет трудности при серийных исследованиях Я всегда сопровождается утратой части раствора, остающегося на стенках посуды, в пипетках и т. д. :

Сухую кровь на предметном стекле в виде соскоба или нити из области пятна на ткани обрабатывали 33% раствором щелочи^ присутствии восстановителя для получения гемохромогена и накрывали покровным стеклом, края которого фиксировали пластилином. Если в результате изменений кровяного пятна гемохромоген не удавалось получить, применяли обработку концентрированной серной' кислотой с образованием гематопорфирина. Препарат переносили на предметный столик микроскопа, установленного, как было описано выше (объектив 40 Х, окуляр 1,0 X). В качестве осветителя применяли эпидиаскоп с кинолампой (110 V, 500 W), питаемой от осветительной сети1 через электрораспределительный щит ШЭ-66, что позволяло регулировать режим тока. Эпидиаскоп помещали на конец рельса спектрографа объективом вплотную к конденсору микроскопа; окуляр последнего находился в 35 см от объектива спектрографа. На бумажном экране, расположенном в плоскости щели или на крышке объектива спектрографа, получалось изображение участка препарата, совмещаемое с расположением щели. Из камер, входящих в комплект спектрографа ИСН-51, целесообразно применять имеющую наибольшую светосилу. Например, 1 : 2,3 и фокусное расстояние 120 мм.

Модификацией описанного выше приема является микроспектрографирование с отечественной спектральной насадкой АУ-16. Заменив ею окуляр микроскопа, можно визуально наблюдать спектры различных участков исследуемого препарата, сравнивая их с контрольными спектрами, и по шкале приблизительно определять длину волны полос поглощения. Однако указанная насадка не имеет приспособления для фотографирования спектров, поэтому мы применили ее в сочетании со спектрографом ИСП-61, используя мощную систему призм последнего.

После визуального исследования спектра поглощения, не меняя положения закрепленного препарата на предметном столике, спектральную призму отодвигали в сторону насадки, наклоняли тубус микроскопа до горизонтального положения и переносили его на подставку перед объективом спектрографа. Компенсационный окуляр насадки помещали на расстоянии 3,6 см от щели спектрографа. Свет от эпидиаскопа,, расположенного сбоку от рельса, направляли с помощью зеркала в осветительную систему микроскопа, и на крышке объектива спектрографа получалось несколько увеличенное изображение щели насадки и той микроскопической частицы препарата, которая подвергалась исследованию. Совместив изображение щели с центром перекрестия на крышке объектива и убедившись по снятии последней, что Спектр, виден на матовом стекле, приступали к фотографированию, во время которого щель спектрографа устанавливали на возможно большее раскрытие.. Описанным путем микроспектроскопический метод, применяемый в большинстве судебно-медицинских лабораторий, может быть дополнен микроспектрографией, а в ряде случаев и микрофотометрированием спектрограммы, что делает возможным объективно обнаруживать наличие самых слабых полос поглощения. Так, в эксперименте нам удавалось наблюдать абсорбцию гемоглобина эритроцитов при исследовании тонких мазков свежей крови на предметном стекле. Для исследования чувствительности метода применительно к экспертному материалу нами было проведено 60 измерений частиц сухой крови при помощи окуляр-микрометра и измерительного микроскопа с последующим переводом в вещества типа гемохромогена и кислый гематопорфирин. Изучение спектров этих продуктов показало, что их абсорбционные свойства позволяют получать ясные полосы поглощения гемохромоге- ков при исследовании частиц диаметром до 5—10 μ и спектр гематопорфирина при растворении глыбок размером до 50 μ. Это различие в чувствительности полностью объясняется свойствами указанных продуктов.

Особый экспертный интерес при установлении минимальных количеств крови представляет продукт из группы гемохромогенов, полученный Шуммом путем плавления кровяного пигмента в феноле. Этот метод, получивший название фенольной реакции, описан О. Шмидтом (Schmidt) в 1936 г. Как показали наши предварительные наблюдения, ценность получаемого деривата гемоглобина заключается в интенсивной абсорбционной способности, намного превышающей таковую у гематопорфирина, и одновременно в возможности получения его из свежей крови, а также из ее следов значительной давности, измененных в результате солнечного облучения, температурных воздействий, присутствия ржавчины и грязи. В настоящее время мы продолжаем работать по изучению свойств указанной реакции в судебно-медицинском аспекте.