Основные источники ошибок при морфологических исследованиях

В повседневной практике морфологи часто встречаются с артефициальными изменениями тканей, которые зачастую образуются при технической обработке (фиксации, проводке, заливке и т.д.), что может создавать объективные трудности при гистологическом исследовании препаратов тканей и может стать источником диагностических ошибок. Источники ошибок можно разделить на две основные группы. Одни из них имеют субъективный характер, являясь результатом недостаточной осведомленности исследователя, неправильных методологических предпосылок при выполнении работы или нарушений законов логики в суждениях и выводах. Другие источники более объективны, существуют независимо от исследователя - это различные помехи, искажающие результаты. Таким помехам присуща известная закономерность. В данной работе мы не будем касаться упущений, зависящих от недостатка опыта и специальных знаний, необходимых для самостоятельной работы, хотя ошибки, возникающие по такой причине, наиболее часты, а иногда имеют роковые последствия. Что же касается объективных помех, то многие из них являются общими для всех морфологов: изменения органов и клеток, которые привносят агония, смерть и трупные процессы, технические артефакты и т.д. Удельный вес отдельных источников ошибок для тех, кто работает с жизненно свежим или с трупным материалом, неодинаков.

Основным объектом микроскопических исследований служит срез, т.е.: препарат, способный показать лишь статичное состояние заведомо умерщвленных тканей и клеток. Но стоит заметить, что и витальная микроскопия не лишена помех. Приемы, открывающие доступ к внутренним органам, или травма, наносимая любыми оптическими устройствами, вводимыми в ткань, нередко вызывают не только повреждения, но и нежелательные реактивные явления.

Живые ткани — кусочки, взятые путем биопсии или вырезанные у только что убитого животного, — наиболее пригодны и для изготовления гистологических препаратов. Но при этом возникают артефакты, появляющиеся в живых тканях в момент разреза или фиксации. Кроме того, в связи с наступлением смерти всего организма происходят изменения, поскольку терминальные расстройства функций (происходящие даже при быстрой гибели) получают свое морфологическое отображение, не всегда учитываемое должным образом.

Наряду с агональными и посмертными изменениями, серьезные помехи создают технические процедуры, которым подвергается материал, подготавливаемый для гистологических исследований. Фиксация, обезвоживание и т.д. всегда в той или иной степени искажают естественное строение живых клеток и тканей.

Уже на самом первом этапе работы морфолога — во время получения материала для микроскопического исследования возникают разнообразные артефакты. Так, например, очень легко возникает ложный ателектаз легкого, сопровождающийся мнимым утолщением межальвеолярных перегородок, на местах, подвергшихся сдавливанию во время осмотра органа и иссечения из него кусочков для исследований. Поверхность разреза ткани, если он сделан недостаточно острым или тупым ножом, делает его практически непригодным для гистологических исследований (так как при этом возникают ложные сдавления ткани, ее разволокнения и т.д., имитирующие травматическое повреждение тканей). В некоторых случаях наблюдаются особые артефакты, обусловленные разносом по поверхности раны обрывков тканей и клеток (чаще это отмечается в кусочках, содержащих кость и полученных путем выпиливания, где опилки могут оказаться в самых разнообразных местах). При вырезании кусочков из органов, имеющих трубчатое строение, частицы поврежденной ткани могут вдавливаться в просвет трубок. Проявляя бережность, пользуясь острыми инструментами и применяя некоторые специальные приемы, удается уменьшить вред, наносимый тканям, подлежащим исследованию.

Артефакты при фиксации. Фиксация играет решающую роль для сохранения структуры тканей, предупреждения развития в них посмертных изменений, а также успешной последующей окраски. Полноценность фиксации зависит от правильного выбора фиксатора в зависимости от цели исследования, от сроков прошедших с момента смерти, от величины фиксированных кусочков, количества фиксирующей жидкости, продолжительности пребывания в ней материала и т.п. Погрешности при фиксации материала служат причиной многочисленных артефактов. Формалин представляет наиболее распространенный фиксатор, и его преимуществом является простота использования, недорогая цена, хорошие диффузионные свойства и достаточное уплотнение тканей. При длительном хранении в нем изменяется pH в кислую сторону вследствие образования муравьиной кислоты, которая мешает хорошей фиксации. Нейтрализация кислой реакции легко достигается прибавлением углекислого кальция. При фиксации формалином, особенно кислым, возможно появление в срезах темно-коричневого пигмента в виде зернышек или глыбок (результат реакции формалина с гемоглобином ткани). Так называемый «формалиновый» пигмент имитирует другие кровяные пигменты (например, глыбки гемосидерина, которые образуются при распаде эритроцитов при травматических кровоизлияниях и повреждениях тканей), что при недостатке опыта морфолога может привести к диагностическим ошибкам, особенно в случаях при определении давности происхождения повреждений.

Артефакты в результате проводки и заливки материала. На оценку морфологических картин существенно влияет ряд факторов при обработке и заливке материала, а также при его резке. Правильный выбор среды для заключения тканей играет важную роль для получения полноценного материала и последующего приготовления срезов и окраски. Как известно, наиболее широко используются для этой цели целлоидин и парафин. Уже при подготовке материала к заключению в целлоидин или парафин ткань при фиксации или набухает (в формалине) либо сморщивается (в алкоголе), а последующая обработка усиливает сморщивание вследствие дегидратации. Все эти процедуры, естественно, изменяют тканевые структуры. Заключение тканей в парафин очень ценно для приготовления тонких серийных срезов в 1-5 мк. Основным его недостатком является нагревание залитого в парафин материала, вследствие чего, например, цитоплазма нервных клеток сморщивается на 8-12 % и интенсивно окрашивается, иногда в ней образуются перицеллюлярные полости. При неполном обезвоживании мозговой ткани парафин не пропитывает ее целиком, она высыхает, и клетки оказываются особенно сильно сморщенными. Подобные изменения в тканях при ошибочной трактовке могут приниматься за явления несуществующего отека либо патологического изменения клеток.

Артефакты и ошибки, связанные с приготовлением срезов. В результате дефектов при приготовлении срезов могут наблюдаться морфологические картины, которые ведут к ошибочным заключениям. Прежде всего, следует подчеркнуть необходимость исследования клеток на срезах не толще 4-7 мк. При наличии более толстых срезов часто получается ложное представление об увеличении количества клеток (глии в ЦНС и т.д.). Толстые срезы также мешают правильной оценке внутренней структуры клеток. Значительная и неравномерная толщина среза обычно зависит от плохой заточки микротомной бритвы, при наличии на ней мелких зазубрин получаются рваные срезы, которые в дальнейшем очень трудно окрашивать и оценивать. Также имеет большое значение направление срезов, так на срезах проведенных тангенциально, создается ложное представление о многослойном расположении клеток, об их пролиферации или об образовании ложных структур, так в мозговой ткани может получиться ложное представление в виде участков выпадения нервных клеток.

Полностью избежать повреждений и артефактов, пожалуй, нельзя. Остается, следовательно, помнить об их возможности, критически оценивая результаты данных изменений и учитывать их при диагностике патологических процессов в органах и тканях.