Установление групповой принадлежности клеток по системе MNSS реакцией смешанной агглютинации

Первые сведения об исследовании антигенной характеристики тканей и органов человека встречаются в материалах, датированных 1928 годом. Ряду исследователей (Кричевский И.Л., Шварцман Л.А., Земцова О.М., Терехова А.А. и др.) с помощью специфической абсорбции антител удалось выявить антигены А и В в тканях печени, легкого, почки, селезенки, желудка, кишечника, матки, яичника, головного мозга, а также в слизистых ротовой полости и влагалища.

С 1956 года начались исследования по установлению групповой пр инадлежности изолированных клеток, когда впервые зарубежными авторами была применена реакция смешанной агглютинации (РСА) для определения антигенов А и В в клетках эпидермиса. Позже зарубежными и отечественными учеными были использованы различные модификации РСА для выявления антигенов системы АВО в изолированных клетках различных органов и тканей, слизистых оболочек.

Впервые в 1984 году Л.О. Барсегянц указала на то, что с помощью РСА в изолированных клетках наряду с антигенами системы АВО могут быть выявлены также антигены М и N системы MNSs. Однако на практике сделать это было почти невозможно.

Трудность определения групп M, N и MN в следах крови и тем более в изолированных клетках реакциями абсорбции-элюции (РАЭ) и смешанной агглютинации (РСА) главным образом была связана с низкой агглютинирующей способностью гетероиммунных сывороток анти-М и особенно анти-N. Большая часть сывороток была способна выявить групповые антигены только в жидкой крови.

Применяемые в настоящее время методы РАЭ и РСА позволяют выявлять антигены в следах крови очень малых размеров. И во многом это стало возможным благодаря появлению нового поколения сывороток и цоликлонов, обладающих соответствующим титром и высокой степенью специфичности.

В связи с неуклонно растущим объемом цитологических исследований и необходимостью антигенной дифференцировки клеток не только по системе АВО нами был проведен ряд опытных исследований по выявлению антигенов М и N в клетках с помощью РСА.

На первом этапе осуществлялись изготовление и подбор контрольных препаратов с заведомо известными группами по системе MNSs: М, N и МN. Для этого готовили три группы препаратов: 1) с клетками влагалищного эпителия; 2) с клетками ротовой полости; 3) с клетками эпидермиса, взятыми из подногтевых пространств.

При этом в первых двух группах препараты подразделяли еще на две части. Одну часть препаратов готовили сразу на предметных стеклах, куда наносили нативные клетки в виде мазков и соскобов. Другая часть препаратов готовилась следующим образом: вырезы из марлевых тампонов с содержимым влагалища и ротовой полости, а также срезы ногтевых пластин помещали в центрифужные пробирки, заливали 25-процентной уксусной кислотой на 18 часов. Затем предметы-носители удаляли из пробирок, жидкость центрифугировали, а осадок переносили на предметные стекла в виде капель.

Таким образом, всего было получено пять групп препаратов, которые на конечном этапе фиксировали 96° спиртом до полного его испарения на стеклах.

В качестве реагентов использовали гетероиммунные сыворотки и цоликлоны анти-М и анти-N. Каждый раз перед исследованием проверяли качество указанных сывороток и цоликлонов, так как титр их может снижаться или, наоборот, повышаться, а показатели специфичности – ухудшаться.

В первую очередь проверяли способность сывороток и цоликлонов агглютинировать стандартные эритроциты, содержащие одноименный антиген. Для этого на плоскость параллельно в трех местах пастеровской пипеткой наносили по 2–3 капли испытуемых сывороток и цоликлонов анти-М и анти-N.

К каждой порции добавляли небольшое количество однократно отмытых стандартных эритроцитов ОМ, ОN и ОМN соответственно. Сыворотки и цоликлоны смешивали с эритроцитами отдельными стеклянными палочками. Плоскость слегка покачивали.

Результаты реакции агглютинации учитывали при ярком искусственном освещении с помощью лупы (фото 1). При этом сыворотки и цоликлоны антиМ должны отчетливо агглютинировать эритроциты типа М, а сыворотки и цоликлоны анти-N – эритроциты типа N в течение 10–15 секунд (проверка агглютинирующей способности сывороток и цоликлонов). Кроме того, сыворотки и цоликлоны типа М не должны агглютинировать эритроциты типа N, а сыворотки и цоликлоны типа N – эритроциты типа М в течение 5 минут и более (проверка специфичности используемых сывороток и цоликлонов).

Фото 1. Проверка агглютинирующей способности и специфичности цоликлонов

Реакция смешанной агглютинации включает в себя два этапа:

• на первом этапе осуществляется специфическое связывание антигенами клеточных мембран гомологичных антител;
• на втором – выявление реакции антиген-антитело на поверхности клеток с помощью одноименных эритроцитов.

При проведении стандартной РСА на препараты с клетками наносят соответствующие сыворотки или цоликлоны в титре 1:128 – 1:256 и инкубируют их во влажных камерах при температуре +4 ... +6 ºС в условиях холодильника в течение 18 часов. Затем несвязавшиеся антитела отмывают охлажденным физиологическим раствором 6 раз по 15 минут, препараты подсушивают при комнатной температуре и добавляют к ним по 2–3 капли 0,25 % взвеси трижды отмытых физиологическим раствором соответствующих тест-эритроцитов. Препараты выдерживают в течение 1,5 часа во влажных камерах в условиях холодильника, накрывают покровными стеклами и проводят учет результатов под микроскопом.

Однако при использовании стандартной техники постановки РСА с различным титром (от 1:128 до 1:256) и сериями сывороток и цоликлонов мы получили отрицательный результат: антигены М и N в исследованных препаратах выявить не удалось.

Затем мы проводили стандартную РСА с инкубированием не в условиях холодильника, а при комнатной температуре. Результаты были также отрицательными.

На следующем этапе исследований был применен вариант постановки РСА без отмывания непрореагировавших антител, разработанный Стегновой Т.В. в 1976 г. для выявления антигенов системы АВО в выделениях и модифицированный Силкиной С.Ю. в 2008 г. применительно к исследованию клеток.

Суть данного варианта сводится к следующему: на препараты с клетками наносят соответствующие сыворотки или цоликлоны в титре 1:128 – 1:256 и инкубируют их во влажных камерах в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем еще 2 часа при температуре +4 ... +6 ºС в условиях холодильника. Затем, минуя удаление сывороток и цоликлонов и отмывание несвязавшихся антител, к препаратам сразу добавляют по 2–3 капли 0,25 % взвеси трижды отмытых физиологическим раствором соответствующих тест-эритроцитов. Препараты выдерживают в течение 30 минут во влажных камерах в условиях холодильника, накрывают покровными стеклами и проводят учет результатов под микроскопом.

При учете реакций был получен неспецифический результат: во всех препаратах наблюдалась выраженная агглютинация эритроцитов как в свободном плавании, так и на поверхности клеток.

Мы попробовали немного изменить постановку реакции, удалив с препаратов сыворотки и цоликлоны и проведя однократное отмывание в течение 10 минут. Результат остался прежним.

Тогда мы стали проводить обычную стандартную РСА, постепенно уменьшая время отмывания несвязавшихся антител с 15 до 5 минут при сохранении их кратности. Впервые нами были получены слабоположительные результаты: на мембранах клеток появились единичные подвижные присоединения эритроцитов (одиночных и мелкими группами – по 2–3 эритроцита). Это послужило поводом использовать сыворотки и цоликлоны с более высоким титром – 1:512. В результате антигены системы MNSs стали выявляться достаточно хорошо как сыворотками, так и цоликлонами.

Таким образом, методом проб и ошибок нами был получен стойкий положительный и достоверный результат. Полученные данные приведены в таблице 1.

Таблица 1

Примечание:
Группа 1 – влагалищные клетки с заведомо известными группами М, N, МN
Группа 2 – клетки ротовой полости с заведомо известными группами М, N, МN
Группа 3 – клетки эпидермиса с заведомо известными группами М, N, МN
а) – клетки, подвергнувшиеся обработке уксусной кислотой
б) – клетки, перенесенные на предметное стекло в виде мазков и соскобов
«+» и «–» обозначают наличие или отсутствие агглютинации
«±» обозначает слабую нестойкую агглютинацию

Как видно из таблицы 1, контрольные образцы клеток необходимо обрабатывать уксусной кислотой для получения четкого достоверного результата.

Таким образом, в настоящее время для определения групповой принадлежности изолированных клеток может быть успешно применена следующая техника постановки РСА:

• 1) препараты инкубируют с соответствующими сыворотками или цоликлонами в титре 1:512 во влажных камерах при температуре +4 ... +6 ºС в условиях холодильника в течение 18 часов;
• 2) несвязавшиеся антитела отмывают охлажденным физиологическим раствором 6 раз по 5 минут и подсушивают препараты при комнатной температуре;
• 3) к препаратам добавляют по 2–3 капли 0,25 % взвеси трижды отмытых физиологическим раствором соответствующих тест-эритроцитов и выдерживают в течение 1,5 часа во влажных камерах в условиях холодильника;
• 4) препараты накрывают покровными стеклами и проводят учет результатов реакции микроскопически.

За положительный результат принимались подвижные присоединения двух и более эритроцитов, как по краю клеточных элементов, так и на их поверхности.